加味四逆散抗DHBV 3TC耐药株和抗炎、抗脂质过氧化作用的实验研究

摘要

1.研究目的 通过体内外实验研究，了解加味四逆散抗HBV和DHBV3TC耐药株的作用，以及对免疫性肝损伤的抗炎、抗脂质过氧化作用，以期探索加味四逆散治疗慢性乙型肝炎及抑制免疫性肝损伤的作用机制和靶点，为临床广泛应用提供科学的依据。 2.实验内容 2.1四逆散加减方体内抗DHBV的实验研究 2.2加味四逆散体内抗DHBV的实验研究 2.3DHBV3TC耐药株的检测 2.4加味四逆散体内抗DHBV3TC耐药株的实验研究 2.5加味四逆散体外抗HBV的实验研究 2.6加味四逆散对小鼠的急性毒性试验 2.7加味四逆散对ConA所致免疫性肝损伤小鼠的保护作用 2.8加味四逆散对BCG+LPS所致免疫性肝损伤小鼠的保护作用 3.实验方法 3.1将先天感染鸭随机分为5组，每组6只。分别为病毒对照组，3TC组，原方组，加味组，去枳组。各组中药醇提物均以20g·kg-1·d-1灌胃；3TC按200mg·kg-1d-1灌胃，共10d。对照组未做处理。分别于T0、T5、T10、P3各时间点采血，分离血清，用斑点杂交法测定血清中DHBV的载量变化。 3.2将先天感染鸭随机分为5组，每组6只。分别为病毒对照组，3TC组，加味四逆散大，中，小剂量组。加味四逆散醇提物分别以20g·kg-1·d-1、10·kg-1·d-1、5g·kg-1·d-1灌胃；3TC按200mg·kg-1d-1灌胃，共10d。对照组未做处理。分别于T0、T5、T10、P3各时间点采血，分离血清，用斑点杂交法测定血清中DHBV的载量变化。 3.33份DHBV阳性血清分别取自2只先天携带DHBV的广东麻鸭和3TC耐药的广州麻鸭。提取DHBVDNA。使用一对扩增DHBVDNA全基因序列的引物，用PCR法扩增全基因序列，取PCR产物10μl进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外线检测仪下观测结果。 3.41日龄广州麻鸭，足静脉注射DHBVDNA3TC耐药株血清，斑点杂交筛选出后天感染DHBV者作为实验动物。动物感染毒种13天后，随机分为6组，每组5-6只。分别为病毒对照组，3TC组，ADV组，加味四逆散大，中，小剂量组。加味四逆散醇提物分别以20g·kg-1·d-1、10·kg-1·d-1、5g·kg-1·d-1灌胃；3TC按200mg·kg-1·d-1灌胃，ADV按100mg·kg-1·d-1灌胃，共10d。对照组未做处理。分别于T0、T5、T10、P3各时间点采血，分离血清，用斑点杂交法测定血清中DHBV的载量变化。 3.5用2.2.15细胞作为细胞模型，将加味四逆散药物原液倍比稀释成7个浓度上药。同时设无药物细胞对照。上药8d后收集上清用ELISA法测定HBsAg、HBeAg。并用MTT法检测药物细胞毒性，计算药物对抗原的半数抑制浓度(IC50)及治疗指数(TI)。3.6NIH小鼠随机分为5组，每组10只。各组剂量分别为160g·kg-1·d-1，80g·kg-1·d-1，40g·kg-1·d-1，20g·kg-1·d-1，10g·kg-1·d-1(相当60kg体重的成人每日每公斤用药量的80倍、40倍、20倍、10倍和5倍剂量)。动物禁食16h后一次灌胃给予受试物，观察14d，记录动物中毒表现及死亡情况，后断头处死动物。 3.7以ConA所致肝损伤小鼠为动物模型，随机分为正常对照组、模型对照组、联苯双酯组、加味四逆散大、中、小剂量组；造模后正常对照组及模型组均灌胃生理盐水0.2ml/只/次，联苯双酯组灌胃联苯双酯，150mg·kg-1·d-1，加味四逆散大、中、小剂量组分别灌胃加味四逆散40g·kg-1·d-1，20g·kg-1·d-1，10g·kg-1·d-1。用药三次后摘眼球采血分离血清检测ALT、AST；IFN-γ、TNF-α；SOD、MDA和NO。断头处死动物，肝脏用10％中性甲醛溶液固定，HE染色，光镜病理观察。采用SPSS10.0软件包进行统计分析。 3.8采用BCG+LPS所致肝损伤小鼠为动物模型。动物随机分为正常对照组、模型对照组、联苯双酯组、加味四逆散大、中、小剂量组；造模后第一天起灌胃。正常对照组及模型组均灌胃生理盐水0.2ml/只/次，联苯双酯组灌胃联苯双酯，150mg·kg-1·d-1，加味四逆散大、中、小剂量组分别灌胃加味四逆散40g·kg-1·d-1，20g·kg-1·d-1，10g·kg-1·d-1。各组均每天灌胃1次，共10天。摘眼球采血分离血清检测ALT、AST；IL-6、TNF-α；SOD、MDA和NO。断头处死动物，肝脏用10％中性甲醛溶液固定，HE染色，光镜病理观察。采用SPSS10.0软件包进行统计分析。 4.实验结果 4.1四逆散加味方组在用药第10天时病毒滴度显著下降，但在停药第3天，血清病毒滴度又有回升，提示加味方在体内有抑制DHBV作用。而四逆散原方和四逆散去枳实方DHBV滴度无下降，提示枳实是四逆散重要的组成部分。3TC组在给药第5天和给药第10天时血清病毒滴度均显著下降，但停药3天时也有明显回升。本实验结果提示了，四逆散加用健脾、祛湿中药可起到抗DHBV的作用。 4.2加味四逆散大剂量组在用药第5天起DHBVDNA含量降低，用药第10天DHBVDNA仍在较低水平，但停药第后3天开始病毒滴度回升；中、小剂量组在整个用药过程中病毒滴度均无明显下降。3TC组在给药第5天和给药第10天时血清病毒滴度均显著下降，但停药3天时也有明显回升。 4.3经DHBVDNA提取并进行PCR扩增后，三组血清DHBVDNA扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，均可扩增出大小约3.0kb的片段，与预期相符。 4.4ADV组在给药第5天、第10天血清DHBVDNA含量下降，停药后3天病毒滴度仍保持在较低的水平，但与自身用药前比较无统计学差异，说明病毒滴度已经开始回升。提示ADV对DHBV3TC耐药株具有抗病毒作用但和3TC等其它核苷类病毒逆转录酶抑制剂一样，存在停药后可能出现病毒滴度的回升的缺点。而大剂量的加味四逆散虽可抑制DHBV，但对3TC耐药株未见有抑制作用，然而从实验结果可以看出，动物体内的DHBVDAN滴度随着用药时间的延长具有下降的趋势，这提示我们加味四逆散可能具有抗3TC耐药的功效。由于中药一般起效较慢，所以这有待于今后延长用药时间、或者是调整药物剂量或药物组成后进一步探讨。 4.5加味四逆散对2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)为＞200mg/ml。对HBsAg，HBeAg的半数抑制浓度(IC50)分别为＜3.12mg/ml和43.68mg/ml；治疗指数(TI)分别为＞64.12和＞4.58。 4.6给药后动物一般状况良好，毛色正常，体重增长，饮食、排便及活动等未见异常，未发现明显的毒性反应，未见动物死亡。 4.7加味四逆散大、中剂量组ALT、AST降低、肝组织病理变化减轻；加味四逆散治疗组血清IFN-γ、TNF-a含量明显低于模型组，表明加味四逆散可通过抑制T淋巴细胞活化和IFN-γ、TNF-a的释放而发挥抗肝损伤作用。而加味四逆散大、中剂量组均能明显升高ConA所致肝损伤小鼠肝组织SOD的活力，降低MDA和NO的含量。 4.8加味四逆散大、中剂量组ALT、AST降低、肝组织病理变化减轻；其中加味四逆散大剂量组血清IL-6、TNF-a含量明显低于模型组，表明加味四逆散也可通过抑制T淋巴细胞活化和IL-6、TNF-a的释放而发挥抗肝损伤作用。同时加味四逆散大、中剂量组均能明显升高BCG+LPS所致肝损伤小鼠肝组织SOD的活力，降低MDA和NO的含量。 5.创新点 5.1以DHBV3TC耐药株强阳性血清为毒种，感染1日龄雏鸭造模成后天感染3TC耐药鸭乙型肝炎模型，进行体内抗3TC耐药株的实验研究，且造模成功。 5.2鸭乙型肝炎动物体内实验提示阿德福韦对DHBV3TC耐药株具有抗病毒作用，与临床ADV用于治疗3TC耐药病人有效的报道一致。 5.3在方法上首次将中医治法方药用于干预3TC耐药株，进行了体内实验研究，其治法为疏肝健脾，清热祛湿，与前人所用之补肾、活血、清热解毒、疏肝理气等组方原则相比具有独特之处，且组方方面加入了广东草药鸡骨草，为岭南特色草药的现代药理研究增加了新的内容。 5.4通过体内实验，初步提示加味四逆散保护免疫性肝损伤的机制与其抗脂质过氧化及抑制NO的产生和降低IFN-γ，TNF-a、IL-6等炎症介质密切相关。 6.结论 6.120g·kg-1·d-1加味四逆散具有体内抗鸭乙型肝炎病毒的作用。阿德福韦对DHBV3TC耐药株具有抗病毒作用，与临床ADV用于治疗3TC耐药病人有效的报道一致。而加味四逆散抗3TC耐药株的疗效不明确。体外实验提示加味四逆散对2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg均有抑制作用。 6.2加味四逆散对小鼠的LD50＞160g·kg-1·d-1，属实际无毒物质。在两种免疫性肝损伤动物模型中，加味四逆散大、中剂量均能起要良好的保肝降酶、抗炎、抗脂质过氧化及改善受损伤小鼠肝脏的病理改变等作用。其机制与其抗脂质过氧化损伤及抑制NO的产生及降低IFN-γ，TNF-a、IL-6等炎症介质密切相关。

目录

文摘

英文文摘

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引言

实验一加味四逆散抗DHBV及DHBV 3TC耐药株的实验研究

实验二加味四逆散抗炎、抗脂质过氧化的实验研究

创新点

全文结论

参考文献

附录

致谢