慢性胃炎脾虚证消化吸收障碍亚型差异表达基因生物信息学及临床研究

摘要

研究背景和目的: 本研究拟重复我们第一批慢性胃炎脾虚证基因差异表达谱的实验工作，考证两批慢性胃炎脾虚证芯片差异表达基因的重复性及差异性，并在此基础上通过对证候症状体症及基因芯片差异表达基因及其编码蛋白功能的生物学信息分析，描绘出脾虚消化吸收障碍亚型差异表达基因的病理生理背景的假设，进一步完善脾虚消化吸收障碍亚型诊断标准。 研究方法： 1、病例选择 受试病例首先需要符合慢性胃炎诊断标准 (临床、胃镜及病理诊断)，然后符合脾虚证／脾胃湿热证辨证标准，同时要排除消化道器质性病变及其他系统严重病变者。 2、收集标本: 在广州中医药大学第一附属医院和广东省中医院按照上述标准收集慢性浅表性胃炎脾虚证患者作为试验组 (脾虚)，慢性浅表性胃炎脾胃湿热证患者作为同病异证证型对照组(脾胃湿热)，从志愿者中选择健康人作为正常对照组(正常)。参照中华医学会消化病学分会2000年井岗山会议标准，经胃镜和病理活检确诊，排除心、肝、脾、肺、肾系等疾患。于(早8:30—11:00)经胃镜下诊断也符合纳入标准后，胃镜下钳夹胃窦部(距幽门口2-3cm)粘膜组织4至5块，取1-2块置于10％福尔马林液中备做病理切片，其余马上置于RNAlATER中，液氮保存，以备制作表达谱芯片BiOstarH-140s。 结果: 1、受试者收集情况 共收集慢性胃炎49例 (全部取胃粘膜)，来源于广州中医药大学第一附属医院和广东省中医院门诊病人；其中脾虚证病人 21例，男7例，女14例，年龄20-57岁，平均年龄 33.9岁，病程3个月-10年以上；慢性胃炎湿热证病人28例，男11例，女17例，年龄19-58岁，平均年龄37.8岁，病程3个月-10年以上；14例正常人胃粘膜无明显病变，基本情况为：男2例，女12例，年龄22～27岁，舌质淡、苔薄白，脉弦或缓。经过RNA提取后进一步筛选，选择RNA提取质量好的病例纳入芯片研究，各组分别选出8例病人进行配对芯片研究。 2、胃粘膜组织病理学观察 入选病例病理切片观察，慢性胃炎脾虚组和脾胃湿热组胃粘膜多出现中性粒细胞、淋巴细胞或浆细胞的浸润，只是程度各不相同，正常人病理切片观察多无明显异常，均符合实验的纳入标准。 3、临床资料分析 3.1 慢性胃炎临床症状及病理分析：慢性胃炎HP与舌苔有统计学意义(P=0.015)，薄白苔者HP阳性率较低(4/17)，而黄腻苔者HP感染率最高(13/17)。HP与性别、病程及病理无统计学意义，但随着病程的延长及病理的加重，HP 的感染率增加，以上情况可能与样本量有关。随着病理炎症程度的加重，腹痛的机率相应增加，但无统计学意义，可能与样本量有关，也有可能表明炎症并不是引起腹痛的唯一原因，与个体的耐受性、饮食、情绪等多种因素相关。另外，慢性胃炎舌体胖大与便溏具有相关性，有显著的统计学意义(tau b=0.384，P=0.007)。 3.2 慢性胃炎脾胃湿热证与脾虚证患者临床资料分析：慢性胃炎脾胃湿热证与脾虚证患者在男女比例、病程、病理程度上无显著差异，在痞满及腹痛症状上有显著差异，脾虚证患者以痞满为主(13/21，62％)，脾胃湿热证患者腹痛多见(22/28，79.8％)：慢性胃炎脾胃湿热证与脾虚证患者在HP感染及食少纳呆上有显著差异，脾胃湿热证HP 感染率明显高于脾虚证(P=0.019)，脾虚患者食少现象高于脾胃湿热证(P=0.005)。 3.3.1 慢性胃炎脾虚证临床症状出现频率：出现率在90％以上的有舌淡有齿痕、食后腹胀、体倦乏力、纳呆等4个症状；作为辨证标准主症的便溏出现频率只有47.6％，提示便溏可能在脾虚证发展到一定程度才会出现；另外提取出现频率在45％以上的临床症状，按主次症积分对脾虚证的轻重程度进行划分。主症仍按照已有的慢性胃炎脾虚证的诊断标准进行。划分原则兼顾定性、定量评分。其中主次症综合分≤5为正常人，≤10 为脾虚轻度，≤为15中度，>15为重度；脾虚主症(舌淡有齿痕、食后腹胀、食少纳呆、便溏)分值高的病人往往伴有次症 (如消瘦、体倦乏力、神疲懒言、失眠等全身症状)分值的增高，主、次症得分合计较高；此外，本组脾虚证患者以轻、中度居多，重度较少。 3.3.2 脾虚症状与慢性胃炎脾虚证程度的关系：便溏、神疲懒言在脾虚程度的划分上有统计学意义(P=0.017，P=0.030)，对中至重度脾虚的诊断有参考意义，而舌体胖大(P=0.069)及消瘦(P=0.067)在脾虚证分度诊断中虽未统计学意义，可能与样本量小有关，但是也呈现出了随着脾虚程度的加重，此两项症状出现的频率增高的现象，在重度脾虚证患者中此两项症状出现率最高，也说明脾虚证程度演变过程是从消化道症状逐渐向全身症状发展的过程。慢性胃炎脾虚证患者脘腹痞满的频率 (13/2l，61.9％)略高于脘腹疼痛 (8/21，38.1％)者。脾虚证失眠与性别无关，体重减轻与便溏无统计学意义，造成体重减轻的原因较多，如纳少、劳累等，但是体重减轻与失眠有统计学意义(tau b=0.748，P=0.001)，分析原因可能是体重减轻的患者多属于中重度脾虚患者，脾主运化水谷，脾虚失运，纳食减少，消化吸收障碍，气血生化乏源，血不养心，以致失眠。 4、基因芯片分析 4.1 慢性胃炎脾虚证与正常组芯片的Ratio值及生物信息学分析 计算本配对组8张芯片中每张芯片上14112点基因探针的Cy5/Cy3的Ratio比值，按照上述所设条件进行分析，得出脾虚证与正常人胃粘膜的差异表达基因共83条。脾虚证与正常人比较，上调24条(28.9％)，下调51条(61.4％)，上下调趋势不明显9条(8.6％)。经检索互联网生物学公共数据库 GeneBank，获得每条基因的名称和其他基本信息。 4.2 t-test分析对“4.1”方法筛选出的83条基因进行t检验，结果有12条基因荧光值的差异满足P<0.05。 对“4.2”方法筛选出的294条基因进行t检验，结果有109条基因荧光值的差异满足 P<0.05，其中下调85条(77.98％)，上调24条(22.02％)。 4.3、聚类分析(分析基因或样本之间的相互关系) 4.4.1 慢性胃炎脾虚证与正常组芯片的基因聚类分析基因聚类分析是通过建立各种不同的数学模型，她把基于相似数据特征的变量组合在一起，归为一个簇的基因在功能上可能相关或关联，从而找到未知基因的功能信息或以知基因的未知功能，但是由于使用数据转换、归一化等因素，导致对聚类分析结果的影响较大；此外，聚类只是为了寻求类，不管所聚类别是否有意义，故需结合基因的生物信息学进行判读。脾虚证与正常组8张芯片筛选出的83条差异表达基因基本可归为5大类(具体内容见论文)。 4.4.2 脾虚证病例的聚类分析 在进行样本聚类时采用所有差异基因进行聚类，探讨聚类结果的差异性。 4.4主要差异表达基因的基因库生物信息资料在两批芯片实验中与蛋白质合成、营养物质吸收、能量代谢、细胞骨架及细胞周期相关基因下调。 以上结果表明慢性胃炎消化吸收障碍亚型患者有其相应的基因背景。 结论: (1)慢性胃炎脾虚证消化吸收障碍亚型有其差异基因表达图谱，主要表现为蛋白质合成代谢、能量代谢及营养物质吸收、细胞周期及细胞骨架相关基因的下调，尤其是蛋白质合成场所的相关基因核糖体蛋白表现集中，将是下一阶段研究的重点；两批芯片在差异基因的上下调趋势比例及基因分类上有较高的一致性，说明诊断标准的可行性、证的稳定性及一定范围内的特异性，但是完全重复且上下调趋势一致的基因较少，除了考虑兼夹证、个体差异、时空差异之外，证候的轻重程度分级也应加以考虑。 (2)证候有以候为证的特点，不同症状群应有相应的基因背景，证候的临床表征和现代生物学基础是一个统一体的两个方面，证候的科学研究，必须紧抓住这两个基本要素。通过对脾虚消化吸收障碍亚型患者临床资料的总结分析，发现次症体倦乏力分布频率靠前，而在基因表达中有与线粒体能量代谢相关基因下调，是否纳入主症范畴有待进一步商榷。主症便溏分布频率只有47％，但与中重度脾虚患者比例明显升高，有显著的相关性及统计学意义，舌体胖大与脾虚程度虽无显著的统计学意义，但呈现出正比的关系，且舌体胖大与便溏有较高的相关性及统计学意义，故认为此两种症状体征可作为脾虚消化吸收障碍亚型程度分级的参考指标，而在对差异基因基础上的脾虚患者样本聚类时亦可发现舌体胖大及便溏患者其综合评分高，这些样本被明显的聚在一起，此类样本与消化吸收相关的基因下调趋势及比例较明显。 (3)证候由于其定位不明确、非定量、涉及多系统、主次症组合辨证的特点，从大范围来研究证候的特异性客观化指标是不现实的，应在某一特定的范围内选择具有典型症状表现的病例进行研究才会有一定的实际意义。 (4)本次基因芯片实验只是从另一个角度研究证候，其得出的结果可与其它指标互相参补，互相支持，并不能取代证候的临床诊断，本研究属于初步探索阶段，仍有大量的问题亟待解决，如：异病同证及类似证的差异基因研究，如何更深层次的进行芯片数据的分析，如何把中医非定量的临床症状信息与病理生理及基因生物信息学更好的融合将任重而道远。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分文献研究

第一章疾病基因芯片研究概况

第二章证候基因组学研究进展

第三章证候特点及实质研究概况

第二部分实验研究

引言

研究方案及技术路线

第一章临床资料分析

第一节实验方法及纳入标准

第二节慢性胃炎患者临床资料分析

第三节慢性胃炎脾虚证与脾胃湿热证患者临床资料分析

第四节脾虚证患者临床资料分析

第二章基因芯片分析

第一节基因芯片实验方法及实验样本资料

第二节慢性胃炎脾虚证芯片数据分析

第三节脾虚证差异基因聚类分析

第四节脾虚病人第一秕与第二批症状评分及差异基因比较

第五节脾虚证与脾胃湿热证的差异基因表达图谱研究

结语

附录

科研病历临床观察表

致谢