益气活血中药复方三芪口服液对早期糖尿病肾病的影响

摘要

目的：
　　探讨益气活血中药复方三芪口服液干预糖尿病肾病的起始点及肾保护作用机制研究。
　　方法：
　　一、临床部分：
　　病例来源：广东省中医院大学城医院的住院及门诊病人共58例。
　　诊断标准：
　　(1)西医诊断标准：
　　①糖尿病诊断标准：参照1999年WHO标准。
　　②糖尿病肾病分期标准：参照Mogensen标准及王海燕《肾脏病学》。
　　I期：肾脏肥大和肾小球高滤过，此期肾脏结构正常。
　　II期：运动后出现微量白蛋白尿，肾脏病理示肾小球毛细血管基底膜(GBM)增厚。
　　III期：持续性微量白蛋白尿，尿白蛋白排泄率(UAER)在20～200μg/min或30～300mg/24h之间，肾脏病理示肾小球系膜基质增加及GBM明显增厚，又称早期糖尿病肾病或亚临床糖尿病肾病。
　　IV期：UAER>200ug/min或持续尿蛋白>500mg/24h，病理示肾小球系膜基质明显增加及GBM明显增厚，部分小球荒废，又称临床期糖尿病肾病或中期糖尿病肾病。
　　V期：肾功能破坏，肾小球荒废，又称终末期糖尿病肾病。
　　(2)中医证型诊断标准：
　　参照2002年版《中药新药临床研究指导原则》中关于气虚证及血瘀证的辨证标准。
　　(3)症状积分标准：
　　症状按无、轻、中、重记0、1、2、3分，舌脉记“有”为1分，“无”为0分。
　　纳入标准：
　　(1)符合以上中西医诊断标准；
　　(2)血糖：FPG≤7.0mmol/L2HPG≤10.0mmol/L，病情稳定二周以上；
　　(3)蛋白尿：24h尿蛋白定量≤0.3g，UAER＜200ug/min。
　　同时具备以上三条方可纳入临床试验。
　　排除标准：
　　(1)排除其它原发及继发性原因所致蛋白尿；
　　(2)无感染、酮症酸中毒、高渗性非酮症糖尿病昏迷、低血糖症等急性并发症；
　　(3)合并原发性及其它继发性肾脏病者；
　　(4)合并严重消化、循环、造血等系统原发性疾病者；
　　(5)严重的精神疾病（经精神科医生会诊）或因其它原因不能配合调查者。
　　监测项目：每二周监测症状、舌脉、血压、餐后2h毛细血管血糖，试验前后各监测尿24h微量白蛋白定量，血清肌酐（SCr）、低密度脂蛋白(LDL-C)、血胆固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、血栓调节蛋白（TM）。
　　疗程：12周。
　　治疗方案：
　　(1)基础治疗：
　　①糖尿病健康教育、体育锻炼及低盐优质蛋白糖尿病饮食：每日食盐摄入量≤6克，精蛋白摄入量：0.8g/Kg·d；
　　②控制血压：目标：＜130/80mmHg；可应用非ACEI及ARB外的所有降压药；
　　③控制血糖：目标：FPG≤7.0mmol/L2hPG≤10.0mmol/L全部应用糖适平和/或胰岛素治疗；
　　④对症处理。
　　(2)分组治疗：
　　T组：三芪口服液：1支/次，3次/日，口服；
　　L组：洛汀新片：10mg/次，1次/日，口服。
　　调查方法：
　　(1)药物洗脱：共2周，停用所有ACEI、ARB、益气活血类中药等制剂；给予受试者DM教育，低盐低脂优质低蛋白饮食；血压控制于＜130/80mmHg水平；血糖控制在FPG≤7.0mmol/L，2hPG≤10.0mmol/L水平；结束复查24h尿微量白蛋白定量及排泄率、血浆TM、低密度脂蛋白(LDL-C)、TCH、TG水平；
　　(2)分组：将合格病例分为洛汀新组(L组)及三芪组(T组)；
　　(3)试验过程依从性：采用药物记量的方法了解患者依从性。耐心向患者做好解释工作，使其充分理解，配合研究。
　　(4)干扰和沾染的控制：所有病人受试期间不得接受试验措施以外的相关药物或治疗，尽量保证病人按照治疗方案规定用药，而不受其他药物等治疗措施的影响。
　　结果：
　　(1)治疗前两组患者一般情况、24h尿微量白蛋白定量、肾功能、血栓调节蛋白等，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗过程中，两组患者血糖差异无统计学意义(P>0.05)；
　　(2)治疗后T组DN患者24h尿微量白蛋白定量、血栓调节蛋白、低密度脂蛋白、症状积分较治疗前明显降低，差异有显著性统计学意义(P<0.01)；
　　(3)治疗后T组与L组比较：T组症状积分前后差值高于L组，差异有显著性统计学意义(P<0.01)；T组LDL-C治疗前后与L组比较，明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。24h尿微量白蛋白定量、血栓调节蛋白等差异无统计学意义(P>0.05)。
　　二、实验部分：
　　实验一：三芪口服液对实验性糖尿病肾病模型大鼠肾组织AGEs/RAGE、PAI-1、TGF-β1表达影响的研究。
　　选鼠分组：选用SD雄性大鼠，设立正常对照组(C组)；余动物采用STZ单次腹腔注射方法制备糖尿病(DM)动物模型。
　　DN模型制备及分组： DM大鼠模型成功后，给予隔日高脂饲料饲养4周，DN大鼠模型成功，随机分为M组、T组。
　　干预起始点：DN模型成功，分组后即开始干预。
　　干预方式：
　　①饲料：T、M组给予隔日高脂饲料，C组给予普通饲料；实验期间均自由进食和饮水；
　　②药物：T组给予三芪口服液灌胃，C及M组给予生理盐水灌胃。
　　干预时限：6周。
　　大鼠淘汰标准：
　　①干预过程中，测定血糖值＜16.8mmol/L者，予以淘汰；
　　②6周后处死大鼠，光镜示肾组织无明显病变者，予以淘汰。
　　标本制备：选择DN模型制备及分组干预后C组、M组、T组大鼠肾组织，每组随机选择6例标本。
　　实验方法：免疫组化法。
　　观察项目：测定肾组织AGEs/RAGE、TGF-β1、PAI－1等的免疫组化染色面积、面密度及积分光密度。
　　实验二：三芪口服液对糖尿病大鼠肾足细胞及其膜蛋白PCX、nephrin表达的影响。
　　标本来源、实验方法同实验一。
　　观察项目：测定肾组织足细胞计数、PCX荧光染色面积，Nephrin、PCX面密度及积分光密度。
　　结果：
　　实验一：三芪口服液对实验性糖尿病肾病模型大鼠肾组织AGEs/RAGE、PAI-1、TGF-β1表达影响的研究。
　　24h蛋白尿定量及排泄率：
　　(1)T、M组24h尿蛋白定量、排泄率较 C组升高，差异有显著性统计学意义(P<0.01)；
　　(2)T组24h尿蛋白定量、排泄率较M组降低，差异有显著性统计学意义(P<0.01)。
　　血尿素氮、肌酐：
　　C、T、M组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。
　　总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白：
　　(1)T、M组TCh、TG较C组均升高，差异有显著性统计学意义(P<0.01)；
　　(2)T组TCh、TG较M组降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
　　AGEs：在肾小球、肾小管、毛细血管、系膜等肾组织均有 AGEs阳性物质存在，胞浆和细胞外基质均有AGEs沉积。和C组比较，M组呈强阳性表达；T组染色面积及积分光密度均较M组降低，差异有显著性统计学意义（P<0.01）。
　　RAGE：主要表达定位在肾小球，和C组比较，在M组表达明显增加；T组染色面积及积分光密度均较M组明显减弱，差异有显著性统计学意义（P<0.05）。
　　TGF-β1：主要定位在肾小管及间质处，肾小球表达较弱；T组免疫组化染色面密度及积分光密度均较M组降低，差异有显著性，差异有显著性统计学意义（P<0.01）。
　　PAI-1：主要表达定位于肾小管、收集管，小球内无表达，和C组比较， M组呈强阳性表达；T组染色面积及积分光密度均较M组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　实验二：三芪口服液对糖尿病肾病大鼠肾足细胞及其膜蛋白PCX、nephrin表达的影响。
　　肾小球足细胞计数：
　　与C组相比，M组肾小球足细胞数明显下降，（P＜0.05），T组肾小球足细胞数亦有下降，但较M组足细胞数为多，结果分析统计有显著差异（P＜0.05）。
　　肾小球足细胞标志性蛋白PCX平均荧光密度：
　　C、M和T组三组肾脏肾小球足细胞PCX荧光密度比较NC组可见PCX阳性信号沿肾小球血管壁走行分布均匀、连续；M组PCX阳性信号分布不均匀，而且不连续；T组PCX阳性信号较M组分布均匀，较M组连续。定量分析结果显示，M组PCX平均荧光密度均低于C、T组(分别降低了48.5%、30.1%)(分别为 P<0.001， P<0.05)。
　　肾小球nephrin蛋白表达：
　　M组大鼠肾小球nephrin蛋白表达显著低于C组（P<0.05）；T组大鼠肾小球nephrin蛋白表达显著高于M组（P<0.05）；T组与C组比较，肾小球nephrin蛋白表达无显著差异（P>0.05）；C组大鼠肾脏nephrin蛋白在肾小球沿毛细血管袢呈线状分布；M组大鼠部分肾小球中nephrin蛋白呈颗粒状分布，三芪口服液治疗能显著抑制DN大鼠肾小球nephrin蛋白的重新分布。
　　肾小球足细胞分析指标与24小时尿蛋白相关性：
　　Pearson相关分析结果显示，24小时UMA与肾小球足细胞PCX平均荧光密度、nephrin蛋白表达呈负相关(P＜0.01)。
　　结论：
　　1.三芪口服液能改善早中期DN患者临床症状、蛋白尿、降低血浆TM水平，稳定肾功能，干预过程中未发现其它不良反应，结果提示可将血栓调节蛋白升高作为干预DN的起点。
　　2.益气活血中药复方三芪口服液对DN肾脏保护作用的机制可能是：抑制AGEs/RAGE系统的表达，从而下调肾组织TGF-β1的表达、减少PAI-1生成，减轻ECM积聚，从而调节细胞、细胞外基质、细胞因子和生长因子间的网络调控，延缓 DN肾间质纤维化及肾小球硬化的进展。
　　3．益气活血中药复方三芪口服液能够上调肾足细胞裂孔隔膜nephrin、足细胞特异性标志蛋白PCX的蛋白表达，从而改善足细胞的损伤，改善肾脏足细胞的超微结构，减少尿蛋白，延缓DN进程。

目录

声明

引言

第一部分 研究背景

1 古代文献有关本病的论述

2 中医药防治糖尿病肾病的实验研究近况

3 糖基化终末产物（AGEs）及其受体(RAGE)与糖尿病肾病

4 足细胞损伤与糖尿病肾病

第二部分 临床研究

1 材料与方法

2 结果

3 结果分析

4 讨论

第三部分 实验研究

实验一 三芪口服液对实验性糖尿病肾病模型大鼠肾组织 AGEs、PAI-1、TGF-β1 表达影响的研究

实验二 三芪口服液对糖尿病大鼠肾足细胞及其膜蛋白PCX、nephrin表达的影响

讨论

1 黄芪的肾脏保护作用

2 三七的肾脏保护作用

3 三芪口服液的肾脏保护作用

4 益气活血中药复方三芪口服液对DN肾脏保护作用的优势探讨

5 不足与展望

结语

1 结论

2 创新点

参考文献

附录

附录一 英文缩略语

附录二 糖尿病肾常见症状积分标准

附录三 附图

研究生在学期间发表论文情况

致谢