葛根素注射液致溶血反应的机制研究

摘要

葛根素(puerarin，4',7－二羟基－8β－D葡萄糖基异黄酮)是习用中药葛根的主要有效成分，在治疗心血管疾病方面有着广泛的应用，主要用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、视网膜动静脉阻塞、突发性耳聋等。
　　随着临床用药的增多，葛根素注射液不良反应的报道日益增多。不良反应主要包括发热、皮疹、肝肾损伤、头痛头晕、血管内溶血等，其中急性血管内溶血发病较为严重，甚至威胁到患者生命。目前，葛根素注射液致溶血不良反应的具体产生机制不明。针对此研究空白，本课题通过体外细胞试验和动物试验，主要从制剂因素、葛根素药源性溶血反应类型、葛根素对红细胞的作用特点等进行研究，探索葛根素注射液致溶血的发生机制，并研究膜稳定剂牛磺酸对葛根素溶血作用的干预，为探寻解决葛根素注射液不良反应的应对措施提供实验依据。
　　本课题在《中国药典》2005年版二部溶血检查项方法的基础上建立了偶发性溶血实验方法，通过提高供试品溶液浓度、延长反应时间，研究葛根素注射液酸碱性及其溶媒丙二醇的溶血作用，发现制剂的酸碱性及丙二醇无溶血作用、葛根素自身具有明显的溶血作用。
　　确定葛根素的溶血作用后，基于临床上药源性溶血反应类型分为：氧化性溶血、免疫性溶血、非免疫性溶血三种，本研究继续考察葛根素注射液药源性溶血反应的类型。按照临床等效剂量，葛根素注射液以50mg/kg的剂量连续静脉给药后，豚鼠体内红细胞过氧化产物丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平均显著低于空白对照组，表明葛根素注射液能够减少红细胞内自由基的氧化作用，对红细胞无氧化损伤的作用；SOD活性的降低可能与葛根素和SOD中的金属离子形成络合物有关；排除了葛根素注射液致溶血反应属于氧化性溶血的可能性。葛根素注射液连续多次静脉给药，未诱发豚鼠出现过敏反应；致敏前后豚鼠红细胞的溶血率相似，表明无免疫性溶血反应的出现；抗人球蛋白直接试验（Goombs实验）结果亦呈阴性，表明多次静脉给药豚鼠体内未产生葛根素抗体，葛根素注射液诱发的溶血反应主要非免疫因素引起。体外溶血实验显示葛根素均能直接致 Beagle犬、豚鼠、人红细胞溶血，溶血率与葛根素浓度呈明显的量效关系；动物实验中葛根素多次静脉注射可直接引起红细胞呈棘状细胞；与空白对照组比较，葛根素注射液给药组动物血清间接胆红素及血红蛋白含量略有升高、红细胞总数下降，但差异无统计学意义；提示葛根素注射液致溶血反应可能与葛根素直接改变红细胞形态、降低红细胞稳定性有关，其溶血反应类型属于药源性非免疫性溶血。
　　基于体外实验葛根素能直接引起红细胞溶血、静脉给药可引起红细胞形态异常，本研究进一步从生理生化反应角度考察葛根素对红细胞脆性、能量代谢、钙离子浓度等的改变，及从葛根素对膜流动性及膜蛋白的影响分析葛根素与膜的结合特点，并讨论这两方面结果与葛根素致溶血的关系。
　　浓度范围0.1~1mmol/L葛根素溶液对红细胞渗透脆性无影响；浓度范围在0.1~2mmol/L的葛根素也未影响高温引起的红细胞脆性增大。钙离子通道阻断剂硝苯地平、维拉帕米均未能抑制葛根素的溶血作用；借助荧光探针Fluo3/AM和流式细胞仪未检测到葛根素引起红细胞钙离子内流。葛根素对红细胞钠-钾-ATP活性无影响；葡萄糖、腺苷亦未能减轻葛根素的溶血作用。以上结果表明葛根素对正常红细胞脆性、细胞内外钙离浓度的平衡、能量代谢均无影响。因此排除葛根素通过引起细胞脆性增加、钙超载或ATP耗损而致红细胞溶血的可能性。
　　值得注意的是，在生理盐水中（NS，pH7.0），葛根素的溶血作用随着浓度的增加、反应时间的延长（≥6h）而增大；在等渗磷酸缓冲液中（PBS，pH7.4），即使葛根素浓度不断增加、反应时间延长，仍未见葛根素有溶血作用。同时，葛根素的溶血作用可被阳离子两亲分子利多卡因所拮抗。
　　基于任何溶血反应必然涉及红细胞膜的损伤，本课题继续考察葛根素在不同溶媒（NS及PBS）中对膜流动性的改变。在NS(pH7.0)中，葛根素显著提高膜的流动性；当葛根素浓度>0.1mmol/L时，膜的流动性未随着葛根素浓度的增加而改变。膜流动性的增加表明葛根素嵌入膜磷脂双层中，可能通过增加膜磷脂分子之间的静电斥力、降低磷脂分子的有序性从而引起膜流动性的增大。在PBS(pH7.4)中，低浓度的葛根素亦显著提高膜的流动性；但当葛根素浓度>1mmol/L时，膜的流动性随着葛根素浓度的增加反而出现降低，推测葛根素与膜磷脂分子之间主要通过氢键的形式结合，氢键作用增强膜的规整性从而抑制膜流动性。
　　由于葛根素属于阴离子两亲分子，与膜磷脂双层的结合部位刚好与阳离子两亲分子利多卡因结合的部位相反，因此对红细胞形态的影响也相反。在本实验中，往含有葛根素的生理盐水溶液中加入利多卡因，可抑制葛根素对红细胞膜流动性的提高，同时亦拮抗葛根素的溶血作用，说明葛根素致溶血的作用与其跟膜的结合特点密切相关。
　　总结在NS或PBS中、在含有利多卡因的生理盐水溶液中，红细胞膜流动性的改变与葛根素致溶血结果的关系，发现有一个共同的特点：在相同的反应体系中，膜流动性下降，红细胞未出现溶血；相反，膜流动性增大，红细胞破裂。由于在本实验中膜流动性的提高与膜表面电荷、磷脂分子的有序性改变有关，因此推测葛根素的溶血作用同其它阴离子两亲分子一样，与其改变红细胞脂膜表面电荷、结构有关，最终导致红细胞“渗漏”、破裂。并且这种“溶血方式”的特征呈时间依赖性，即反应时间越长，溶血程度越明显。
　　除了影响红细胞脂膜，葛根素还改变膜蛋白的表达。体外细胞实验中葛根素明显降低膜蛋白尤其是骨架蛋白的表达；动物连续给药后红细胞骨架蛋白中血影蛋白（以β型为主）、锚蛋白、带3、带4.1的表达略有下降。体外实验表明高浓度的葛根素溶液对红细胞膜蛋白的影响较为明显；动物试验中，葛根素静脉注射对红细胞膜蛋白的影响不明显，这可能由于药物快速代谢不易在体内形成持续的高血药浓度有关。但是无论体外体内实验结果均表明一定浓度或剂量的葛根素会破坏红细胞膜的完整性、稳定性。
　　葛根素与膜稳定剂牛磺酸配伍而成的复方葛根素注射液对红细胞膜流动性的影响与葛根素注射液相似，但未有溶血作用，静脉注射液亦未引起红细胞形态异常。提示牛磺酸能够稳定红细胞膜的完整性，降低葛根素对膜的破坏和抑制葛根素的溶血作用。
　　总之，本实验从细胞和动物两方面进行了较为系统的葛根素注射液致溶血发生机制的研究，确定了葛根素注射液药源性非免疫性溶血的反应类型，发现高浓度的葛根素改变红细胞膜的结构、规整性是葛根素致溶血的前提。葛根素对膜的作用特点与其它阴离子两亲分子一致，葛根素非特异性作用于红细胞，降低葛根素浓度（剂量）、添加膜稳定剂牛磺酸均可消除葛根素的溶血作用。该实验为临床消除或减少葛根素注射的不良反应的应对措施提供了实验依据。

目录

声明

前言

参考文献

第一部分 文献综述

一、葛根素的药理研究进展及不良反应

1 药代动力学

2 葛根素药理作用研究进展

3 葛根素注射液不良反应

4 展望

参考文献

二、黄酮类化合物与双层磷脂膜

1 黄酮类化合物与膜的结合特点

2 黄酮类物质对膜理化性质的影响

3 黄酮类化合物对膜形态、功能的影响

4 小结

参考文献

第二部分 研究内容

一、葛根素注射液致溶血反应的析因研究

1 材料与仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

二、葛根素注射液药源性溶血反应类型的研究

1 材料与仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

三、葛根素注射液致溶血发生机制的探索

1 材料与仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

四、葛根素与牛磺酸配伍后对红细胞作用特点的研究

1 材料与仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文小结

讨论

1、对于多数患者，适量的葛根素注射液引起溶血的可能性极小

2、临床上葛根素注射液给药剂量过大，潜在诱发不良反应的危险性

3．完善葛根素注射液在特殊病理模型、特殊人群身上的药理学、药动学、毒理学的研究

发表论文

致谢