石斛提取物及丁香酸对H2O2损伤的HLECHLEC的防护作用

摘要

目的:
　　探讨中药金钗石斛提取物中四种不同极性的生物碱（脂溶性、水溶性、低极性、弱极性）及丁香酸对人晶状体上皮细胞（HLEC）氧化损伤防护作用的影响。为开发抗白内障新药进行了早期研究。
　　方法:
　　1、不同极性生物碱的提取，金钗石斛粉末经乙醇提取、降膜浓缩、酸化、盐析、萃取后；水洗、回收可得脂溶性生物碱；酸化、氯仿萃取回收获得弱极性生物碱；将酸化后并用氯仿萃取的酸水层浓缩再碱化回收得低极性生物碱；碱化后用正丁醇萃取、饱和水洗回收获得水溶性生物碱。通过单因素实验，确定影响金钗石斛生物碱提取率的因素。
　　2、HLEC生长曲线的绘制，HLEC用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，常规消化，按每个小方瓶5×104／mL密度传代接种细胞，共接种21瓶细胞，24h后开始计数细胞，后每隔24h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7 d。根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。
　　3、将H2O2与传代培养的HLEC共同孵育复制氧化损伤模型，同时加入不同极性的金钗石斛提取物作用24h后，用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测HLEC的增殖情况，流式细胞术检测其凋亡情况，并探讨不同极性及同一极性不同浓度的金钗石斛提取物对氧化损伤后细胞增殖及凋亡的影响。
　　4、将H2O2与传代培养的HLEC共同孵育复制氧化损伤模型，同时加入白内停、脂溶性生物碱和不同浓度的丁香酸作用24h后，用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测HLEC的增殖情况，流式细胞术检测其细胞周期情况，并探讨不同浓度丁香酸对氧化损伤后细胞增值及周期的影响。比较白内停、脂溶性生物碱低剂量与丁香酸对氧化损伤后细胞增殖及周期的影响的不同。
　　结果:
　　1、分离得到金钗石斛不同极性生物碱，通过单因素实验，确定影响金钗石斛生物碱提取率的因素分别是提取溶剂的浓度、提取次数和提取时间。
　　2、根据细胞计数结果可得HLEC的生长曲线呈“S”型。
　　3、H2O2组抑制HLEC增殖，金钗石斛脂溶性生物碱和水溶性生物碱高剂量组可促进氧化损伤的HLEC的增殖，其中脂溶性生物碱可显著促进氧化损伤的HLEC的增殖（p<0.01）。脂溶性生物碱可以明显抑制H2O2诱导的HLEC凋亡（p<0.01），其作用与白内停差异无统计学意义（P>0.05）。
　　4、H2O2组抑制HLEC增殖，丁香酸较低剂量组可促进氧化损伤的HLEC的增殖，其作用与白内停和脂溶性生物碱低剂量组差异无统计学意义（p>0.05），丁香酸抗氧化损伤的最佳有效剂量为0.2mg/ml，0.8mg/ml具有细胞毒性作用。H2O2组S%所占比例较小，丁香酸、白内停和脂溶性生物碱可以对其进行调节三者之间差异无统计学意义（p>0.05）。
　　结论:
　　金钗石斛各极性生物碱用80%乙醇提取3次，每次提取3h时提取效果较好。HLEC的生长曲线呈“S”型。金钗石斛脂溶性生物碱低剂量组通过抗氧化损伤作用促进HLEC的增殖，抑制HLEC的调亡。其抑制HLEC的凋亡作用与白内停差异无统计学意义。丁香酸通过抗氧化损伤作用促进HLEC的增殖的最佳有效剂量为0.2mg/ml，0.8mg/ml的丁香酸具有细胞毒性作用，丁香酸能调节氧化损伤HLEC的细胞周期，作用与白内停和石斛脂溶性生物碱三者差异无统计学意义（P>0.05）。

目录

声明

引言

第一部分 研究背景

一、 白内障氧化损伤机制及其治疗现状

（一） 白内障氧化损伤的发病机制

（二） 白内障抗氧化剂的治疗

二、 HLEC凋亡与白内障的关系及药物治疗

（一） HLEC凋亡的形态学特点和生物学特征

（二） HLEC凋亡的基因调控

（三） HLEC与白内障的实验研究

（四） 防治HLEC凋亡的抗白内障药物

三、 石斛的化学成分及其药理作用

（一） 化学成分

（二） 药理作用

第二部分 实验研究

第一章 金钗石斛不同极性生物碱的提取分离工艺研究

一、 材料与仪器

二、 实验方法及结果

三、 讨论

第一章 金钗石斛提取物HLEC活性和凋亡的影响

第一节 HLEC的培养及生长曲线

第二节 金钗石斛提取物对氧化损伤HLEC增殖活性和凋亡的影响

第三节 丁香酸对氧化损伤损伤HLEC增殖活性和细胞周期的影响

第三部分 结语与展望

（一） 总结实验结果，得出以下结论

（二） 尚存在的不足及对本研究的展望

参考文献

附录Ⅰ 英文缩略词表

附录Ⅱ 论文彩图

附录Ⅲ 硕士期间发表论文

致谢