成人MSCs体外定向成骨分化及激素性股骨头坏死MSCs活性研究

摘要

研究目的：
　　1．骨髓间充质干细胞（MSCs）具有自我增殖和多向分化潜能，然而MSCs在骨髓中含量极少，如何在体外获得足够的、纯度较高的、生长状态良好的成人MSCs是进行各项研究的关键。课题拟建立一套简便可靠的成人MSCs分离、纯化、培养、扩增及鉴定体系，并定向诱导MSCs向成骨细胞分化。通过了解成人MSCs的部分生物学特性，可用于指导临床，并为后续利用干细胞组织工程学技术修复股骨头坏死奠定实验基础。
　　2．中医药运用“整体观念”全身辨证治疗股骨头坏死已经取得了显而易见的优势，但是目前大部分中医临床工作者对于股骨头坏死整体观念的认识，仍然局限于基于临床证候的主观推导与枯燥中基理论的反复辨析，尚缺乏令人信服的客观实验依据，尤其是与坏死发生密切相关的全身细胞学改变尚未完全清楚，从而导致整体观念认知程度不高。本课题试图用找到一条途径，通过对激素性股骨头坏死患者MSCs活性的研究，为股骨头坏死整体观念提供客观实验依据。
　　3．激素性股骨头坏死的发病机制尚未完全清楚，认识股骨头坏死的发病机制对于判断受累髋关节的预后、选择治疗方案至关重要。本课题试图从成人MSCs的增殖活性与成骨分化角度探讨并完善激素性股骨头坏死发病机制，并为之提供实验依据。
　　研究方法：
　　1．抽取健康成人髂前上棘处骨髓，采用密度梯度离心法与贴壁筛选法相结合，对MSCs分离、纯化、培养并扩增。倒置相差显微镜下观察MSCs的形态学，透射电镜观察细胞超微结构，MTT法检测不同代细胞的增殖活性，绘制生长曲线，流式细胞仪对第3代MSCs进行表面抗原鉴定。
　　2．在前一部分实验的基础上，以适量地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C配制成骨诱导液，诱导第3代MSCs向成骨细胞分化。检测成骨诱导后第4、8、12、16天ALP活性，采用ALP染色与茜素红染色鉴定成骨细胞。
　　3．在前两部分实验研究的基础上，采用临床病例对照研究的方法与实验研究相结合，于2010年5月起按照设计的诊断标准、纳入标准和排除标准募集病例，骨坏死组为激素性股骨头坏死患者，正常对照组为无骨坏死且骨髓组织无异常的患者。两组病例行髂前上棘骨髓标本取材，均进行MSCs的提取、培养、扩增及诱导成骨细胞分化。对比观察两组细胞学形态；MTT法检测两组各入选对象第2代 MSCs的增殖活性，绘制每组细胞平均生长曲线图；对各入选对象第3代MSCs进行成骨诱导，检测诱导后第4、12天细胞的ALP活性。以上各检测项目进行两组病例的组间比照。
　　研究结果：
　　1．成人MSCs呈现长梭形、纺锤状，原代培养早期为集落样生长，8-11天左右细胞进入快速增殖期，逐渐融合成片，排列有一定方向性。
　　2.传代培养的MSCs第0-2天为生长潜伏期，3-7天为对数增长期，8-9天进入平台期。生长曲线呈S型，在5代之前具有较好的生长特性。随着传代次数增加，细胞的生长状况有衰减的趋势。
　　3.透射电镜显示MSCs表面粗糙，可见较多的微绒毛突起。细胞核大，不规则，常偏于一侧，细胞胞质丰富，各种细胞器成熟，有大量核糖体、粗面内质网和较多的线粒体，可见大量蛋白分泌物。
　　4．流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达，成人MSCs相对特异性抗原CD44的阳性表达为94.81%，CD90的阳性表达为93.15%，而几乎不表达造血细胞表面抗原标志CD34、CD45（分别为2.87%、2.02%）。
　　5．MSCs成骨诱导后，细胞形态较不规则，诱导7天左右出现聚集成团生长，细胞之间连接致密，约14-20天后形成钙化结节。
　　6．成骨诱导4天后ALP活性即有所提高，ALP活性随培养时间而增高，并在第12天时达到高峰，各时间点成骨诱导组ALP活性均高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。成骨细胞ALP染色、茜红素染色均呈阳性。
　　7．骨坏死组与正常对照组的MSCs生长状态有明显不同，正常对照组原代细胞集落数目明显多于骨坏死组，细胞密度较高，倍增较快；而骨坏死组集落形成较慢，个数少，较稀疏，细胞倍增较慢。成骨诱导后正常对照组一般7天左右可见细胞团块形成，而骨坏死组细胞团块出现时间较晚，约在10天左右形成。
　　8.骨坏死组MSCs在不同时间的平均增殖活性要低于正常对照组，从第3天起差异有统计学意义（P＜0.05）；两组细胞平均生长曲线图提示，骨坏死组 MSCs增殖速度缓慢，对数生长期缩短，平台期提前。
　　9.成骨诱导后，随时间推移，骨坏死组与正常对照组的ALP活性均逐渐提高，符合 MSCs向成骨细胞分化的特性。但处于同一时间段，骨坏死组的平均 ALP活性均低于正常对照组，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　研究结论：
　　1．采用密度梯度离心法可以获得纯度较高的单个核细胞，再根据 MSCs的贴壁特性，经过换液、消化、传代可以进一步将MSCs纯化。在加有成骨诱导剂的培养基里可以分化为成骨细胞。本实验建立的成人MSCs体外培养、鉴定及诱导成骨细胞分化体系，可以获得纯度较高、成骨分化能力较好的MSCs。
　　2.与正常人相比，骨坏死组病例 MSCs增殖活性与成骨分化能力均下降，这在激素性股骨头坏死的发病机制中可能起到重要作用。
　　3.激素性股骨头坏死患者 MSCs活性的异常可能是全身性的而并不仅仅局限于股骨头周围，股骨头坏死是由激素引起的全身性病理改变的一个局部反映，“整体观念”可以获得客观的细胞学实验证据的支持。

目录

声明

引言

第一部分 成人MSCs体外培养、鉴定及部分生物学特性研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

五、参考文献

第二部分 成人MSCs体外定向诱导成骨细胞研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

五、参考文献

第三部分 激素性股骨头坏死MSCs增殖活性与成骨分化能力改变研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

五、参考文献

结语

本课题创新点

不足与展望

文献综述:骨髓间充质干细胞在股骨头坏死领域中的应用进展

附录

在读期间发表论文

致谢