“肾藏志应恐”的神经生理机制及补肾方药效应研究

摘要

目的:
　　从情志活动调控的角度，以中医固有理论——“肾藏志，在志为恐”为指导，以机体的恐惧反应记忆为切入点，依据“从病理药效推导生理”的研究思路，从恐惧记忆的形成、巩固、提取和消退以及杏仁核——海马——前额叶皮质神经通路的可塑性，阐释肾虚伤恐的病理机制，结合补肾方药的药理学效应，揭示肾（肾精）调控情志活动的物质基础、作用方式及其内在的神经生物学机制，从而对“肾藏志应恐”理论的科学内涵进行丰富和创新，展示其在现代精神心理学中的科学价值及其实践指导意义。
　　方法:
　　一、建立两种肾虚动物模型。
　　二、恐惧记忆形成与提取实验：
　　对大鼠进行条件恐惧的获得性训练（CS+US），以僵住反应时间(freezing)为检测指标，探讨肾虚对恐惧记忆的形成、巩固和提取的影响以及补肾方药的效应。
　　三、恐惧记忆消退实验：
　　对已建立的恐惧反应大鼠进行恐惧消退训练（CS），以僵住反应时间为检测指标，探讨肾虚对恐惧记忆消退的影响以及补肾方药的效应。
　　四、条件性恐惧反应杏仁核——海马——前额叶皮质神经通路可塑性的研究：
　　在恐惧记忆形成和提取及恐惧记忆消退两个不同阶段对各组观察对象的杏仁核——海马——前额叶皮质神经通路的可塑性进行观察，探讨肾虚伤恐的病理机制和补肾方药的效应及机理，揭示肾（肾精）调控情志活动的物质基础、作用方式及其内在的神经生物学机制。检测指标包括：1.杏仁核、海马、前额叶皮质脑区NMDA受体2B亚型受体（NR2B）和GABA受体α1亚型受体（GABAα1R）表达的检测：免疫组织化学法和原位杂交法。2.杏仁核、海马、前额叶皮质脑区cAMP反应元件结合蛋白（CREB）、丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）表达的检测：采用免疫组织化学法。
　　结果:
　　1.反复给予CS+US联合刺激能够显著增加实验大鼠僵住时间百分比， CS+US非联合刺激则不然。
　　2.肾虚对海马脑区MAPK、GABAα1R、NR2B，杏仁核脑区CREB、NR2B以及前额叶皮质脑区NR2B有上调作用。条件性恐惧刺激则是进一步激活了这些脑区的NR2B，并且上调了CREB在杏仁核脑区的表达以及改变海马脑区GABAα1R的含量。
　　3.龟鹿二仙膏上调了老年大鼠海马脑区GABAα1R的含量、下调杏仁核脑区GABAα1R的含量。龟鹿二仙膏下调了房室不节肾虚模型大鼠海马脑区的CREB、GABAα1R、NR2B以及杏仁核脑区的CREB、MAPK含量。龟鹿二仙膏还下调了海马以及杏仁核脑区CREB的表达，以及海马脑区NR2B的表达。补肾方药下调房室不节肾虚模型大鼠海马脑区的GABAα1R的含量；上调老年大鼠海马脑区GABAα1R含量、下调杏仁核脑区GABAα1R的含量。
　　4.所有实验大鼠经过消退训练后，僵住时间百分比相比较于各组相对应的对照组均显著下降，但是补肾方药并未促进恐惧消退。
　　5.房室不节肾虚模型实验大鼠相对于空白组大鼠下了调海马脑区CREB、MAPK、GABAα1R、NR2B以及杏仁核脑区MAPK的含量。
　　6.龟鹿二仙膏上调了恐惧消退后房室不节肾虚模型实验大鼠海马脑区NR2B、CREB以及杏仁核脑区GABAα1R的表达，并且抑制杏仁核脑区MAPK的表达。
　　结论:
　　1.反复给予CS+US联合刺激能够使实验大鼠获得条件性恐惧记忆，而CS+US非联合刺激则不能。
　　2.肾虚是通过激活海马、杏仁核、前额叶皮质脑区的NR2B，或者还与电压门控性Ca2+通道的Ca2+内流同时参与，引发产生长期突触重塑的细胞内级联反应，从而在这些脑区产生LTP，以促进条件性恐惧记忆的形成与储存。肾虚通过激活海马脑区的MAPK，从而促进该脑区LTP的形成，以促使恐惧记忆的形成。而条件性恐惧刺激则是通过进一步激活这些脑区的NR2B，进而产生LTP，以形成条件性恐惧记忆。此外，改变海马脑区GABAα1R的含量也是条件性恐惧记忆形成、巩固、提取之一。
　　3.补肾方药是通过降低CREB的含量，从而抑制长时程记忆的形成。龟鹿二仙膏通过下调海马脑区谷氨酸受体NMDA亚型NR2B，从而抑制ERK、ERK的激活，以达到抑制该脑区的突触可塑性和记忆。海马、杏仁核脑区的GABAα1R含量变化是补肾方药抑制条件性恐惧记忆形成、巩固、提取的机制之一。
　　4.补肾方药是通过降低CREB的含量，从而通过抑制长时程突触增强或易化效应，进而抑制长时程记忆的形成，实现恐惧消退。同时，恐惧消退训练还下调海马脑区NR2B含量，从而抑制ERK、ERK的激活，以达到抑制该脑区的突触可塑性和记忆。此外，海马、杏仁核脑区MAPK的下调，也抑制了其活化CREB的作用，从而抑制长时程记忆的形成是。最后，下调海马脑内抑制性神经递质GABA受体GABAα1R，进而减少其对消退训练对所习得的新的记忆的负性调节，也是恐惧消退的机制之一。5龟鹿二仙膏通过抑制恐惧消退后房室不节肾虚模型实验大鼠海马脑区NR2B的表达，从而中止和抑制恐惧消退。龟鹿二仙膏还上调了海马脑区的CREB的表达成，其数量的增加或活性的增强可促进长时程记忆的形成，由此可以进一步促进条件性恐惧记忆，以抑制恐惧消退。此外，通过抑制杏仁核脑区MAPK的表达进而阻止消退，也是龟鹿二仙膏抑制恐惧消退的机制之一。最后，上调杏仁核脑区抑制性神经递质GABA受体GABAα1R，以增加其对消退训练所习得的新的记忆的负性调节，进而抑制恐惧消退。

目录

声明

引言

第一部分 文献研究

一 “肾藏志应恐”与情志调节相关的研究进展

二 恐惧记忆的神经生物学研究进展

三 条件性恐惧消退的神经生物学机制

四 条件性恐惧记忆的形成以及条件性恐惧消退的脑回路

参考文献

第二部分 实验研究

第一节 肾虚对于恐惧记忆的形成、巩固、提取的影响以及补肾方药的效应

实验一 肾虚实验动物模型的制作

参考文献

实验二 肾虚大鼠恐惧记忆的形成、巩固、提取的行为学指标影响以及补肾方药的效应

参考文献

实验三 补肾方药改善恐惧记忆形成、巩固、提取的机制研究

参考文献

第二节 肾虚对条件性恐惧记忆消退的影响以及补肾方药的效应

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三部分 结语

一 研究结论

二 创新点

三 存在问题

四 研究展望

附录

致谢