毛冬青部位及成分对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

摘要

目的：
　　通过体外培养大鼠乳鼠心肌细胞，构建心肌缺氧/复氧损伤模型，在细胞水平模拟大鼠心肌缺血/再灌注损伤，研究毛冬青药材不同部位与成分对体外培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。
　　方法：
　　取出生1～3天以内的SD大鼠乳鼠心肌组织，用0.1%胰蛋白酶和0.04%Ⅱ型胶原酶消化，将心肌细胞收集到含10%马血清和7%胎牛血清的DM EM培养基中，用差速贴壁分离法和5-溴脱氧尿苷相结合分离、纯化心肌细胞。采用α-actin抗体进行免疫组化染色鉴定心肌细胞，用台酚蓝染色检查心肌细胞成活率。采用CCK-8结合Caspase-3/7检测不同缺氧/复氧时间细胞凋亡RF U值，建立缺氧/复氧损伤模型。以毛冬青药材不同部位与成分进行干预。心肌细胞随机分为17组：空白对照组(Contro l， C)；缺氧/复氧组(hypoxia/reoxygenation，H/R)；毛冬青低极性部位低、中、高剂量干预组(LL、LM、LH+H/R)；毛冬青中极性部位低、中、高剂量干预组(ML、MM、MH+H/R)；毛冬青高极性部位低、中、高剂量干预组(HL、HM、HH+H/R)；毛冬青单体Ilexoside E低、中、高剂量干预组(EL、EM、EH+H/R)；毛冬青单体Pubescenoside A低、中、高剂量干预组(AL、AM、AH+H/R)。缺氧4h/复氧4h后，采用CCK-8法测心肌细胞存活率；Caspase-3/7检测调亡RFU值；生化手段检测培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷草转氨酶(AST)活性；检测细胞内超氧化物歧化酶(SO D)活性及脂质氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量。
　　结果：
　　1.培养24小时后可见部分单个心肌细胞搏动，48小时后可见心肌细胞相互连接同步搏动；免疫组化染色后可见培养的细胞是心肌细胞，心肌细胞成活率达95%。
　　2.缺氧/复氧模型建立的条件为缺氧4 h/复氧4 h，该条件下测得的校正值与均匀设计分析得到的理论最大值极为接近，在一定程度内使心肌细胞凋亡最大化。
　　3.与空白对照组比较，缺氧/复氧组心肌细胞存活率显著降低(29.33±1.55%vs.99.21±0.78%，P<0.01)，细胞凋亡明显增加(20866±875 vs.80133±1532，P<0.01)；与缺氧/复氧组比较，除Pubescenoside A低剂量干预组外，毛冬青药材不同部位与成分各剂量干预组心肌细胞存活率均显著升高，细胞凋亡明显减少。
　　4.与空白对照组比较，缺氧/复氧组心肌细胞LDH、AS T及CK的外漏量显著增加(0.1234±0.0063vs.0.3751±0.0005、0.2645±0.0046 vs.0.4878±0.0047、0.1505±0.0064 vs.0.4054±0.0053，P<0.01)，表明心肌细胞明显损伤；心肌细胞内MDA含量显著增加(0.0087±0.0006vs.0.0198±0.0003，P<0.01)，SOD活性显著下降(0.1204±0.0041 vs.0.0373±0.0055，P<0.01)，表明缺氧/复氧组细胞清除氧自由基能力降低。与缺氧/复氧组比较，毛冬青药材不同部位与成分大部分剂量干预组可显著降低缺氧/复氧损伤心肌细胞LDH、CK、AST的外漏量(P<0.01)；可显著提高缺氧损伤细胞内SOD活性(P<0.01)，减少MDA的产生(P<0.01)。
　　结论：
　　本课题应用的方法可获得状态好、高成活率的大鼠乳鼠心肌细胞，是一种可靠的心肌细胞培养方法。成功建立心肌细胞缺氧/复氧模型，模拟心肌缺血/再灌注时受到的损伤，同时在一定程度内使心肌细胞凋亡最大化，有利于对药物保护作用进行筛选。毛冬青药材不同极性部位，尤其是中极性部位，与两个单体成分Ilexoside E和Pubescenoside A能够显著减轻缺氧/复氧对体外培养大鼠乳鼠心肌细胞的损伤，降低细胞膜通透性，增强心肌细胞清除氧自由基的能力，有效地保护心肌细胞。

目录

声明

引言

第1章 文献研究

1.1 临床背景

1.1.1 缺血/再灌注与心肌损伤

1.1.2 缺血/再灌注与心肌细胞凋亡

1.1.3 氧自由基与心肌细胞凋亡

1.1.4 心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的建立

1.1.5 药物预适应

1.1.6 抗心肌缺血/再灌注损伤药物

1.2 毛冬青文献研究

1.2.1 毛冬青的化学成分

1.2.2 毛冬青的质量控制

1.2.3 毛冬青药理作用

第2章 实验研究

2.1 大鼠乳鼠心肌细胞的原代培养及鉴定与缺氧/复氧模型的建立

2.1.1 材料与方法

2.1.2 乳鼠原代心肌细胞的分离与培养

2.1.3 心肌细胞和成纤维细胞鉴别

2.1.4 缺氧/复氧模型建立条件筛选

2.1.5 结果

2.1.6 讨论

2.2 毛冬青药材不同部位与成分药效评价

2.2.1 材料与方法

2.2.3 实验分组

2.2.4 存活率与凋亡指数

2.2.5 标本检测前的处理和保存

2.2.6 标本检测方法

2.2.7 统计学处理

2.2.8 结果

2.2.9 讨论

结语

1．基于各组间药效比较探讨毛冬青抗心肌缺血/再灌注的药效物质基础

2．基于给药剂量探讨毛冬青抗心肌缺血/再灌注的药效强度

3．基于毛冬青的抗炎作用探讨其对心肌缺血/再灌注损伤炎症因子的影响

4．中药应用于心肌细胞缺氧/复氧模型进展

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢