菟丝子及其有效部位提取物补肾安胎药效研究

摘要

目的：
　　提取减味寿胎丸复方及其君药菟丝子的有效部位总黄酮、总多糖并进行鉴定，制备各提取成分的含药血清，建立人早孕细胞滋养层细胞（CTB）模型；分别以肾虚-黄体抑制病证结合动物流产模型大鼠及CTB细胞模型为载体，以各有效部位溶液及含药血清为研究对象，观察各浓度溶液及含药血清对流产模型大鼠的流产抑制情况及对细胞增殖活力及凋亡的影响，筛选有效部位提取物补肾安胎、维持妊娠药效的最佳剂量，并初步探讨其可能的作用机制。
　　方法：
　　1.药物提取及成分鉴定：采用超声提取法，醇提+水提工艺提取减味寿胎丸及菟丝子总提物；菟丝子水提物经醇沉多糖后，过滤所得液体上大孔树脂柱，收集30%和60%乙醇洗脱部分，合并浓缩即得菟丝子总黄酮；菟丝子水提物浓缩并加高浓度乙醇，搅匀静置，过滤，沉淀部分合并浓缩至干即得多糖醇沉样品；过滤所得液体上大孔树脂，收集水洗部分浓缩即得多糖水洗样品。紫外分光光度法和苯酚硫酸法测定黄酮及多糖含量；高效液相色谱法（HPLC）进行各提取物的鉴定。
　　2.菟丝子提取物的药效学研究：以羟基脲和米非司酮建立的肾虚-黄体抑制病证结合模型为药效学工具，将SPF级SD孕鼠随机分为13个组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、减味寿胎丸组、菟丝子总提物高、中、低剂量组、菟丝子总黄酮高、中、低剂量组、菟丝子总多糖高、中、低剂量组，每组10只。观察大鼠一般情况及流产症状；计算胚胎数及流产率；测量单侧子宫、卵巢及单个胚胎湿重；放射免疫法检测大鼠血清孕酮（P）及雌二醇（E2）水平；实时荧光定量PCR法检测子宫蜕膜及卵巢PR、ER mRNA表达的差异，初步探讨各成分的可能作用机制。
　　3.提取物含药血清的制备及其对CTB细胞的干预研究：SD雌鼠随机分为8组：空白组；减味寿胎丸组；菟丝子总提物高、低剂量组；总黄酮高、低剂量组；总多糖高、低剂量组；每组5只，大鼠每天灌胃给药2次，连续3天，末次给药后1h取血离心分离血清，制备含药血清并灭活备用。无菌条件下取人早孕绒毛组织进行CTB原代培养并鉴定，建立 CTB细胞模型。以制备的含药血清干预细胞，噻唑蓝（MTT）法及流式细胞术分别检测吸光度值和细胞周期分布情况，观察各组含药血清对CTB细胞增殖活力及凋亡的影响。
　　结果：
　　1.成功提取了减味寿胎丸及菟丝子总提物，并对菟丝子总黄酮及总多糖等有效部位进行分离，所提取的菟丝子黄酮含量为55.938%；总多糖平均含量为13.891%。并进行了提取成分鉴定，为后续动物及细胞实验研究奠定了物质基础。
　　2.菟丝子不同有效部位提取物对流产模型大鼠流产情况的影响：
　　2.1对大鼠一般情况的影响：模型组大鼠造模后陆续出现肾阳虚的表现，阳性对照组及各提取物组个别大鼠亦出现类似表现，但出现时间较模型组推迟，且在实验后期症状逐渐改善；各组大鼠妊娠 D5、D10、D11天体重增加量比较无显著统计学差异（P均>0.05）。
　　2.2对模型大鼠胚胎数及流产情况的影响：各组大鼠总胎数比较无显著统计学差异（P>0.05），而活胎数及流产数则有显著统计学差异（P<0.05），模型组、减味寿胎丸组、菟丝子总提物低剂量组、总多糖高剂量组活胎数较正常组显著减少（P<0.05）；而总提物中剂量组、总黄酮低剂量组较模型组显著增加（P<0.05）。流产数比较，模型组、减味寿胎丸组、菟丝子总提物高、低剂量组、总黄酮中剂量组、总多糖高剂量组均较正常组显著增多（P<0.05）；而地屈孕酮组、菟丝子总提物中剂量组、总黄酮高、低剂量组、总多糖中、低剂量组较模型组显著降低（P<0.05）。
　　流产率比较，模型组、减味寿胎丸组、菟丝子总提物高剂量组、总黄酮中剂量组、总多糖高、中、低剂量组均较正常组显著升高（P<0.05或P<0.01）；而地屈孕酮组、菟丝子总提物高、中、低剂量组、总黄酮高、中、低剂量组、总多糖中、低剂量组与模型组比较均有显著统计学差异（P<0.05或P<0.01）；菟丝子各组间比较提高活胎数，降低流产率效果最好的分别为总提物中剂量组、总黄酮低剂量组及总多糖中剂量组。
　　流产症状情况比较，正常组与模型组阴道出血率有显著差异（P<0.05），模型组与地屈孕酮组及总黄酮低剂量组比较有显著差异（P<0.05）；子宫瘀血情况比较，模型组较正常组及各治疗组均增高，菟丝子总提物高剂量组、总黄酮低剂量组及总多糖中剂量组与模型组比较均有显著差异（P<0.05）。
　　2.3对模型大鼠脏器湿重的影响：各组单侧子宫及卵巢湿重比较无显著统计学差异（P>0.05）；单个胚胎湿重比较，模型组、地屈孕酮组及各实验组较正常组均显著减轻（P<0.05或P<0.01）；而地屈孕酮组、菟丝子总提物高、中剂量组、总黄酮中剂量组、总多糖高、低剂量组较模型组则显著增加（P<0.05）；这与肉眼观察可见治疗组胚胎较模型组大，宫腔瘀血程度轻于模型组的实验结果一致。
　　2.4对血清内分泌激素的影响：血清P比较，地屈孕酮组、减味寿胎丸组、菟丝子总提物高剂量组、总黄酮高、低剂量组均较模型组显著增高（P<0.05或P<0.01）；各提取物组间对血清P水平改善情况比较，效果最好的分别为菟丝子总提物高剂量组，其次为菟丝子总黄酮低剂量组和菟丝子总多糖高剂量组。
　　血清 E2比较，模型组、总多糖低剂量组较正常组显著降低（P<0.05）；而菟丝子总提物中、低剂量组、总黄酮高、中、低剂量组均较模型组显著升高（P<0.05）；菟丝子各提取物组间对血清E2水平改善情况比较，效果最好的为菟丝子总黄酮高剂量组，其次为菟丝子总提物低剂量组和菟丝子总多糖中剂量组。
　　2.5对模型大鼠子宫蜕膜及卵巢组织PR mRNA和ER mRNA表达的影响：子宫蜕膜PR mRNA水平比较，模型组、菟丝子总提物低剂量组、总黄酮低剂量组、总多糖高、中剂量组显著低于正常组（P<0.05或P<0.01）；而地屈孕酮组、寿胎丸组、总提物高剂量组、总黄酮高、中剂量组及总多糖低剂量组均显著高于模型组（P<0.05或P<0.01）。卵巢PR mRNA表达水平比较，寿胎丸组、菟丝子总提物中剂量组、总多糖高、低剂量组均显著低于正常组（P<0.05）；而菟丝子总提物高、低剂量组、总黄酮中、低剂量组均显著高于模型组（P<0.05）。菟丝子各组间综合比较对子宫蜕膜及卵巢组织PR mRNA表达影响最大的提取物为菟丝子总黄酮，其次为菟丝子总提物及菟丝子总多糖。
　　各组大鼠子宫蜕膜及卵巢ER mRNA表达水平比较，模型组均低于正常组，但各组间比较无显著统计学差异（P均>0.05）。
　　3.提取物含药血清对CTB细胞增殖活力及凋亡情况的影响：
　　3.1对细胞增殖活力的影响：各提取物高、低浓度的含药血清培养细胞48h后，490nm波长的吸光度值均有一定程度的增加，尤其是各组10%、20%含药血清与空白对照组均有显著差异（P均<0.05或<0.01）。5%、10%、20%浓度的含药血清分别培养细胞48h后，490nm波长的吸光度值逐渐增加，显示细胞增殖活性随含药血清浓度升高而增加，呈明显的剂量依赖性。菟丝子各提取物组间比较，增强细胞增殖活性效果最好的组别分别为：总提物低剂量组、总黄酮高剂量组及总多糖高剂量组。
　　3.2对细胞周期分布的影响：不同组别提取物10%含药血清干预细胞24h后，与空白血清组比较，各组S期细胞百分比均显著增加（P<0.05或<0.01）；而G2/M期细胞百分比显著减少（P<0.05或<0.01）；G1/G0期细胞百分比则无显著统计学差异（P均>0.05）。分别用空白对照血清及10%含药血清培养细胞48h后，细胞周期分布变化趋势与24h一致，而且变化更加明显。菟丝子各提取物组间比较，对细胞周期分布影响效果最好的组别分别为：总提物低剂量组、总黄酮高剂量组及总多糖高剂量组。
　　结论：
　　1.本研究优化确定了菟丝子有效部位提取制备工艺，并对各提取成分进行含量测定及鉴定。成功制备各提取物含药血清并建立CTB细胞模型，对菟丝子总提物、总黄酮及总多糖在维持妊娠方面的药效作用及量效关系进行系统对比研究，亦与减味寿胎丸复方总提物进行药效比较。
　　2.以肾虚-黄体抑制流产模型大鼠为研究载体，用胚胎数、流产率、血清 P、E2以及PR、ER基因表达水平等为药效指标,证实菟丝子总提物、总黄酮及总多糖均可降低流产率，具有补肾安胎的作用。多指标综合分析，补肾安胎药效最佳剂量为总黄酮低剂量，其次为菟丝子总提物中剂量及总多糖中剂量。
　　3.以 CTB细胞模型为研究载体，初步发现菟丝子各提取物高、低剂量含药血清均可增加CTB细胞的增殖活性，降低细胞凋亡的发生。药效最佳剂量分别为：菟丝子总提物低剂量、总黄酮高剂量及总多糖高剂量。

目录

声明

引言

第一章 文献研究

第一节 中医药防治自然流产的研究进展

1.中医药对生殖内分泌系统调节的研究

2．中医药对生殖免疫系统调节的研究

第二节 寿胎丸防治流产的临床及实验研究

1. 临床研究

2. 实验研究

第三节 菟丝子的研究概况

1. 化学成分

2. 菟丝子药理作用的研究

3. 菟丝子黄酮的药理作用研究

4. 菟丝子多糖的药理作用研究

5. 小结

参考文献

第二章 实验研究

第一节 减味寿胎丸复方及君药菟丝子有效部位的提取

1. 实验目的

2. 实验材料及方法

3. 提取样品的含量测定

4. 提取样品的鉴定

5. 讨论

参考文献

第二节 菟丝子有效部位提取物对肾虚流产模型大鼠的影响

1. 实验目的

2. 实验材料及方法

3. 观测指标及方法

5. PR及ER mRNA的表达检测

6. 统计学分析

7. 结果

8. 讨论

参考文献

第三节 菟丝子提取物含药血清的制备及其对CTB细胞增殖及凋亡的影响

1. 实验目的

2. 实验材料及方法

3. 动物含药血清的制备方法及步骤

4. 人早孕滋养层细胞的原代培养和鉴定

5. 噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖活力

6. 细胞周期分析

7. 统计学方法

9. 讨论

参考文献

讨论

1. 动物模型及药效指标选择的依据

1.1关于肾虚-黄体抑制病证结合大鼠流产模型

1.2 药效指标及检测方法的选择

2. 人早孕CTB细胞模型的研究价值

3. 小结

结语

1. 结论

2. 创新之处

3. 不足之处与展望

参考文献

附录

在读期间发表论文

附图

致谢