聚乙烯亚胺-三聚磷酸钠纳米基因载体的制备及性能评价

摘要

基因治疗有三个重要因素，即目的基因、转基因载体和靶细胞。目前，应用于基因治疗的载体主要有2大系统即：病毒载体系统和非病毒载体系统。前者转染效率高，是目前应用于体内基因治疗的主要手段，但存在安全性隐患及潜在免疫原性，在体内不能反复应用。而后者具有安全性高、免疫原性低、转染操作方便等优点，但是转染效率较低是最为关键的问题。
　　随着高分子生物降解材料的应用不断推广，人们发现以这类材料制备的纳米颗粒具有稳定、低毒、无抗原性、生物相容性好、生物可降解性及对基因有保护作用等优点，而且经修饰可增强靶向性；是良好的纳米基因转运载体材料。而聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是最常用的阳离子多聚物非病毒载体，PEI可把质粒DNA缩合成数纳米级大小的颗粒，通过表面的阳离子的静电作用吸附到细胞表面上，被动内吞。PEI在吞噬泡内不能降解，同时也可保护DNA免受溶酶体降解；另外，PEI有渗透性肿胀效应，导致吞噬泡破裂，使DNA进入胞浆，并促进DNA进入细胞核。但是因为PEI所带的正电荷过高导致了其具有较高的细胞毒性从而限制了应用推广。
　　本研究中以PEI和三聚磷酸钠（triplyphosphate,TPP）为基质，以阴离子凝聚交联方法制备获得PEI-TPP纳米颗粒作为基因转运载体，对其进行表征，包括粒径大小、Zeta电位、体外释放试验，以及红外光谱分析。同时检测PEI-TPP转运载体对DNA的保护作用，进入细胞情况、转染效率及细胞毒性。结果表明所制备的PEI-TPP纳米颗粒可以作为质粒DNA和siRNA的转染载体，且在不同肿瘤细胞（转入荧光报告基因）中转染效率比单一使用PEI高1.38-4.28倍不等，细胞存活率达90%以上而且在体外可以抵抗DNA酶的消化达2小时。以激光共聚焦显微镜观察纳米粒进入细胞的实况发现转染1小时后纳米粒可以进入到细胞浆，并随时间的推移积聚的量不断增多。由此可见，新制备的PEI-TPP纳米转运载体不但降低了单一PEI的毒性，提高细胞存活率，而且可以有效进入细胞和保护质粒DNA不被破坏，转染效率也高于PEI，PEI-TPP还可以有效转染siRNA，效率比PEI高2.51倍。除此之外，PEI-TPP纳米颗粒在转染时除抑制hela细胞的自噬外，对其他常见细胞系并不引起明显细胞自噬。因此， PEI-TPP纳米载体是一种具备良好生物安全性和高转染效率的非病毒类基因转运载体，具有潜在的应用前景。

目录

声明

引言

第一部分 聚乙烯亚胺纳米颗粒（PEI NPs）的制备、表征及其与质粒DNA连接

1 材料

1.1 主要试剂

1.2主要仪器

1.3主要溶液配制

2 主要实验方法

2.1 PEI-TPP纳米颗粒的制备

2.2 PEI-TPP纳米颗粒的表征

2.3 高纯度质粒DNA的制备

2.4 凝胶阻滞试验

2.5 DNA保护试验

3 结果

3.1 PEI-TPP纳米颗粒的制备和表征

3.2 凝胶阻滞试验

3.3 DNA酶保护试验

4 讨论

第二部分 PEI NPs 基因载体体外转染效率及毒性分析

1. 材料与方法

1.1 试剂和仪器

1.2 细胞系

1.3 菌种和质粒

2 方法

2.1 感受态细胞的制备

2.2 pEGFP-C1质粒转化

2.3 pEGFP-C1质粒高纯度大量提取

2.4 PEI-TPP纳米材料进入细胞观察

2.5 体外转染效率

2.6 细胞毒性分析

3.1 细胞摄入试验

3.2 体外转染效率分析

3.3 PEI-TPP体外转染的毒性分析

4 讨论

第三部分 PEI NPs对细胞自噬的影响

1 材料

1.1 实验材料

1.2 主要仪器

2 实验方法

2.1 细胞的复苏、传代与培养

2.2 EGFP-LC3质粒转染

3.1 GFP-LC3 荧光点状聚集分析

3.2 LC-3蛋白表达

4 讨论

结语

参考文献

附录

在校发表论文情况

致谢