肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠“脑肠轴异常”调控作用的分子机制及相关差异蛋白的分析

摘要

目的：探讨肠激安胶囊对腹泻型肠易激综合征(IBS-D)模型大鼠血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT)含量的影响；探讨肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织NPY mRNA的表达和CGRP mRNA表达的影响；建立IBS-D模型组和对照组结肠组织蛋白质双向电泳图谱，结合质谱技术鉴定并分析差异表达蛋白，对候选表达差异蛋白进行蛋白质功能和相关研究，进一步阐明IBS-D脑肠轴异常机制。
　　方法：⑴将SD大鼠随机分为正常组，模型组，匹维溴铵组(0.018 g/kg)，肠激安胶囊高(2.812 g/kg)、中(1.406 g/kg)、低(0.703 g/kg)剂量组，每组8只，模型组以及给药组采用母乳分离+醋酸刺激+四肢束缚法制备IBS-D大鼠模型，各组按20 mL/kg灌胃给药，正常组和模型组给予等剂量的生理盐水，连续给药14天，采用ELISA法检测各组大鼠血清中ACTH和CORT的含量。⑵采用实时荧光定量PCR检测大鼠下丘脑和结肠组织中NPY和CGRP mRNA的表达：取冻存组织，加液氮研磨后按每100 mg组织加入1 mL Trizol试剂，总RNA的提取按Trizol试剂说明书进行，用琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性，用紫外分光光度计检测总RNA的纯度和含量。引物序列如下： NPY：上游5'-TTCAGCCACCCGAGAT-3'，下游5'-GCTTATGACCCGCACTTA-3'；CGRP：上游5'-ATCCATAACATGACAGCATGG-3'，下游5'-CAGTTCTTTAAGCATTGGTTCCA-3'；内参18S：上游5'-CGACACTACATCAATC-3'，下游5'-ATACAACGACAACAAG-3'。荧光定量 PCR总反应体积25?L，反应体系为：12.5?L SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix，前后引物各1?L，1?L cDNA，9.5?L ddH2O。反应条件:94℃5 min；94℃30 s，55℃40 s，72℃50 s，共35个循环；最后72℃7 min结束反应，运用2-△△Ct法计算各组下丘脑和结肠组织中NPY和CGRP基因的相对表达量。⑶采用双向凝胶电泳法分离 IBS-D模型组和正常对照组结肠差异蛋白，运用MALDI TOF/TOF串联飞行时间质谱仪进行鉴定，运用 Gene Ontology和 Pathway Studio生物信息学方法将所鉴定的差异蛋白进行功能分类，分析IBS-D病理机制中关键蛋白和涉及到的相关通路。
　　结果：①与正常对照组比较，IBS-D大鼠血清中ACTH含量明显升高(P<0.01)，肠激安胶囊高、中剂量组均显著降低大鼠血清中ACTH含量(P<0.01)；与正常对照组比较，IBS-D大鼠血清中CORT含量明显升高(P<0.01)，肠激安胶囊高、中剂量组均明显降低大鼠血清中CORT含量(P<0.05)；肠激安胶囊治疗IBS-D的机制可能与下调HPA轴中ACTH和CORT含量有关。②通过荧光定量 PCR研究肠激安胶囊对 IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织中NPY mRNA和CGRP mRNA表达的影响，结果表明，与正常对照组比较，IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织中NPY mRNA表达明显降低，肠激安胶囊高、中、低剂量均能明显提高IBS-D模型大鼠下丘脑NPY mRNA的表达，肠激安胶囊高、中剂量均能明显提高IBS-D模型大鼠结肠NPY mRNA的表达；与正常对照组比较，IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织中 CGRP mRNA表达明显增加，肠激安胶囊高、中剂量组均能明显降低IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织CGRP mRNA的表达。③运用蛋白组学的方法寻找 IBS-D模型组和正常对照组结肠的差异表达蛋白特征谱，结果发现差异倍数在2.5倍以上的差异蛋白有15个：氯离子通道蛋白1(Chloride intracelluLar channel protein1，CLIC1)；硫氧还蛋白(Thioredoxin，TRX)；热休克蛋白(10 kDa heat shock protein，HSP10)；细胞角蛋白8(Cytokeratin-8，CK8)前梯度同源蛋白2(anterior gradient homolog2，AGR2)；肌动蛋白辅助蛋白类似蛋白(Coactosin-like protein，COTL1)；淋巴细胞胞浆蛋白1(lymphocyte cytosolic protein1， LCP1)；蛋白质磷酸酶2调节亚基1A(protein phosphatase2, reguLatory subunit A， PPP2R1A)；烯醇化酶3( Enolase3)；泛醇细胞色素 C还原酶核心蛋白Ⅰ(Ubiquinolcytochrome c reductase core protein I，UQCRC1)；泛醌NADH脱氢酶Fe-S蛋白1(NADH dehydrogenase Fe-S protein1，NDUFS1)；细胞色素 C氧化酶亚基5B( Cytochrome coxidase subunit5B， COX5B)；二磷酸3核苷酸酶1(3'(2'),5'-bisphosphate nucleotidase1，BPNT1)。
　　结论：肠激安胶囊高中剂量组治疗IBS-D的机制可能与下调IBS-D脑肠轴异常的机制中HPA轴ACTH和CORT的含量有关；肠激安胶囊对IBS-D大鼠脑肠轴异常机制有调节作用，其作用机制可能是通过上调下丘脑和结肠组织NPY mRNA表达和下调下丘脑和结肠组织CGRP mRNA表达有关；热休克蛋白、硫氧还蛋白、氯离子通道蛋白等可能是IBS-D脑肠轴异常机制中潜在分子标志物。

目录

声明

前言

第一章 肠易激综合征“脑肠轴异常”机制及治疗的研究进展

1．IBS“脑肠轴异常”机制

2 肠易激综合征的治疗

3 总结

第二章 肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠血清中ACTH和CORT含量的影响

1 引言

2 材料与方法

3 研究结果

4. 讨论

第三章 肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织NPY mRNA和CGRP mRNA 表达的影响

1 引言

2 材料与方法

3 研究结果

4 讨论

第四章 IBS-D大鼠模型组和正常组结肠组织2-DE图谱的建立及差异蛋白的鉴定

1 引言

2 材料与方法

3 研究结果

4 讨论

结语

参考文献

附录

在学期间参与课题、发表论文与获奖情况

致谢