补肾解毒法对猴艾滋病干预作用的免疫学、病毒学及病理学研究

摘要

目的：艾滋病仍然是是威胁人类健康的一大杀手，被称为“超级癌症”和“世纪杀手”。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)大大降低了AIDS的死亡率，然而HAART治疗存在的诸多问题：毒副作用较大，需长期用药，易出现药物抗性仍然难以解决。中医药在改善 HIV/AIDS患者临床症状体征、提高生存质量方面效果显著，有着其它药物不可替代的作用，但是对其疗效的评价尚缺乏肯定的共识。临床观察显示，以补肾解毒为主要原则组方而成的艾可清胶囊可以明显增加HIV感染者的体重，改善生存质量。因此阐释补肾解毒法对艾滋病干预作用的机理机制对于中医药治疗艾滋病的疗效评价、体现中医治疗艾滋病的科学性以及大规模推广应用意义重大。
　　猴艾滋病模型是公认的研究艾滋病的“金标准”，广泛用于艾滋病发病机理及抗艾滋病药物与疫苗的作用研究，已经建立了该模型并对其开展了多年的研究。本研究主要从免疫学、病毒学、病理学等方面研究补肾解毒法方药对猴艾滋病模型的干预作用。
　　方法：采用符合实验要求的中国产恒河猴15只，均经静脉感染 SIVmac239，随机分为三组：低剂量组（相当临床试验用量）、高剂量组（相当3倍临床试验用量）和模型对照组，每组5只实验猴。感染后77天开始给予补肾解毒法方药治疗，连续给药8周，模型对照组同期以生理盐水灌胃。每4周采集一次外周血，每8周采集一次浅表淋巴结。首先利用定量PCR检测外周血病毒载量、用流式细胞术分别检测了T细胞功能亚群、纯真亚群、记忆亚群，用酶联免疫法检测了NK细胞表面CD56的表达量和外周血IL-21含量；其次用放射免疫法检测了血清T3(三碘甲腺原氨酸)、T4(甲状腺素)、COR（皮质醇）和β2-MG（血清β2微球蛋白）这些经研究证明与脾虚证侯和肾虚证候密切相关的指标；最后对各组实验猴的浅表淋巴结做病理，进行HE染色，比较全面阐释了15只实验猴外周血和浅表淋巴结的免疫和病理的动态变化特点。
　　结果：
　　1.本研究发现 CD4+C28+和 CD8+C28+在三组中的变化趋势比较相似，但是CD4+CD28-和CD8+CD28-在三组中的变化趋势相反：对照组中下降，而治疗组中上升，尤以低剂量组中升高明显。低剂量组中 CD8+CD28-细胞大量增加，考虑可能产生了免疫耐受，从而抑制了CD4活化、增殖。故而在CD4下降的同时，没有出现病毒载量的明显增加，体重没有降低，也没有出现死亡猴。
　　2.在本研究中，记忆细胞 CD4+CD45RA-和 CD8+CD45RA-三个组中均下降，符合艾滋病进展规律；而纯真细胞CD4+CD45RA+和CD8+CD45RA+的变化趋势，三组各不相同：对照组CD4和CD8纯真细胞均下降；低剂量组CD8纯真细胞显著升高；高剂量组中CD4和CD8纯真细胞均升高，推测纯真细胞的升高有可能是患者服用补肾解毒方药生存质量改善的一个重要因素。如果补肾解毒方药与HAART合用，使患者纯真T淋巴细胞的升高出现时间提前，可以相对缩短患者的免疫重建时间，从而避免免疫重建之前感染的发生，对患者来说是一个福音。
　　3.与对照组相比较，没有观察到补肾解毒方药明显的降低病毒载量作用，这可能和对照组中病毒载量最高的541猴在实验期间死亡，而同属对照组的543猴又把病毒载量控制到了“测不到”的水平，所以导致对照组病毒载量均数低于治疗组。另外研究发现，IL-21含量与病毒载量拷贝Log强相关，IL-21含量明显高的543猴能很好地控制病毒载量，这对于疫苗研制及艾滋病的防治都有一定的指导意义，其机制值得深入研究。中药高剂量组IL-21含量随时间延长轻微上升，推测补肾解毒方药可能有一定的升高IL-21作用。
　　4.研究中发现：在给药前即感染后2个半月时，部分实验猴的T4值低于正常参考范围，即开始出现脾虚证候；在停药8周即感染后6个月时，三组均出现T3、T4、COR不同程度下降，其中COR的下降，有统计学意义，但三组中实验猴的COR值又都在正常参考值范围内，说明SIV猴模型感染6个月后开始有出现肾虚证侯的趋势，提示进入此阶段后需加强补肾的力度。对于这些指标的影响，治疗组与对照组未发现明显差异。
　　5.猴淋巴结病理显示：随着病程的延长，SIV对照组组中实验猴淋巴结结构逐渐转坏，符合SIV感染猴模型的自然病理变化规律；而治疗组的低剂量和高剂量组不管是治疗期间还是停药后其淋巴结结构基本保持稳定，甚至“转好”。提示中药高、低剂量组对SIV猴模型有一定的治疗作用，且呈一定的量效关系。
　　结论：补肾解毒法方药虽然没有显示出明显的抑制SIV病毒的作用，但是它能升高纯真T细胞数目，对血清IL-21含量也有一定升高作用，确实是一个可贵之处；此外，在病理方面，不管是治疗期间还是停药后治疗组淋巴结结构基本保持稳定，甚至“转好”，提示补肾解毒法方药对SIV猴模型有一定的治疗作用。推测这些因素有可能是它在临床上能改善患者生存质量的原因所在。

目录

声明

引言

第一部分 文献研究

1.1艾滋病发病机理

1.1.1 艾滋病的病因病机

1.1.2 艾滋病HIV病毒的生活史

1.1.3 艾滋病的临床症状与诊断

1.2 艾滋病的治疗方法

1.2.1 西医治疗方法

1.2.2 中医治疗方法

1.3 与HIV/AIDS进展相关联性指标

1.3.1 NK细胞表面CD56表达量对于抗HIV virus治疗的表现标志

1.3.2 CD45RA 对于抗HIV virus治疗的表现标志

1.3.3 CD28对于抗HIV virus治疗的表现标志

第二部分 实验研究

2.1 材料和方法

2.1.1 实验动物

2.1.2 试验用病毒株及感染方法

2.1.3 中药制备及分组给药方案

2.1.4 观察指标

2.1.5 实验试剂

2.1.6 主要仪器与设备

2.1.7 实验方法

2.2 实验结果

2.2.1 SIV猴模型一般情况

2.2.2 病毒载量及T淋巴细胞亚群变化情况

2.2.3 SIV猴模型血常规、血生化主要指标变化情况

2.2.4 SIV猴模型T细胞功能亚群变化情况

2.2.5 SIV猴模型T细胞纯真亚群和记忆亚群变化情况

2.2.6 SIV猴模型NK细胞表面分子CD56的表达量与血清IL-21含量变化情况

2.2.7 SIV猴模型中医证候相关指标给药前后变化情况

2.2.8 541猴与543猴各项指标对比情况

2.2.9 SIV猴模型浅表淋巴结病理学检测结果

2.3 讨 论

2.3.1 免疫学方面

2.3.2 病毒学方面

2.3.3 血常规血生化指标方面

2.3.4 中医证候相关指标方面

2.3.5 病理学方面

结语

创新之处

不足之处

展望

参考文献

附录

致谢