化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞影响的实验研究

摘要

目的：
　　比较输卵管妊娠滋养细胞和宫内早期妊娠滋养细胞生物学特性的异同；探讨化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞侵袭、凋亡及ER、PR表达水平的影响，研究输卵管妊娠的微环境调控机制及化瘀消癥杀胚中药复方作用效应的分子作用机制。
　　方法：
　　（1）两种滋养细胞的体外培养：按照纳入标准选择早期输卵管妊娠患者的输卵管妊娠绒毛组织及宫内早期妊娠人工流产绒毛组织，差异贴壁法分离培养原代滋养细胞，对其行免疫细胞化学鉴定、传代扩增至实验需要的细胞量；
　　（2）采用CCK-8法绘制两种滋养细胞（宫内/宫外）的生长曲线；
　　（3）采用扫描电镜观察输卵管妊娠与正常宫内早孕滋养细胞表面形态的异同；采用透射电镜观察化瘀消癥杀胚中药复方作用前后输卵管妊娠滋养细胞内部微观形态结构的变化；
　　（4）制备化瘀消癥杀胚中药复方水提醇沉液，与输卵管妊娠滋养细胞共培养48小时后，①采用 Transwell小室方法观察化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞侵袭能力的影响；②采用蛋白质印迹法（Western Blot）观察化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡相关蛋白Fasl和caspase-3的表达的影响；③采用实时荧光定量（Real-time)PCR法观察化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞ER m-RNA和PR m-RNA表达水平的影响。
　　结果：
　　（1）成功培养了输卵管妊娠滋养细胞及正常宫内早孕滋养细胞，免疫细胞化学鉴定结果显示细胞胞浆中有CK-18、cerb-2阳性信号，未见波形蛋白信号。
　　（2）两种滋养细胞生长曲线：正常宫内早孕、输卵管妊娠滋养细胞生长周期大致相同：无论是正常宫内早孕还是输卵管妊娠滋养细胞，5×103个/mL、1×104个/mL、5×104个/mL这三个浓度梯度的滋养细胞分别在第5d、第3d、第1d开始进入指数增长期，三者在接种后的第7d均达到平台期；接种浓度为1×103才开始出现增长的趋势。
　　（3）扫描电镜比较清晰地观察到两种滋养细胞表面丰富的微绒毛样结构，二者外观形态无明显差异，二者均有细胞融合的现象。透射电镜观察到化瘀消癥杀胚中药复方作用前的输卵管妊娠滋养细胞胞膜表面光滑、完整，可见微绒毛，胞质密度高，无空泡，核内染色质分布均匀、核仁大较完整，居中或边移；细胞器亚微结构清晰、完整；经化瘀消癥杀胚中药复方（5mg/mL）作用后输卵管妊娠滋养细胞细胞体积皱縮变小，细胞表面微绒毛减少，核膜消失，核质萎缩、碎裂，个别形成凋亡小体；部分染色质固缩，沿核膜形成数个团块状边集，核仁裂解；细胞器外渗、肿胀，空泡状明显增多；内质网扩张呈泡状，与质膜融合，或见细胞骨架解体倾向。
　　（4）正常宫内早孕滋养细胞和输卵管妊娠滋养细胞侵袭能力的比较：两种滋养细胞的穿膜个数差异无统计学意义（P=0.348），即可以认为两种细胞的侵袭能力无差别。
　　（5）化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞侵袭能力的影响：高、中、低不同剂量中药复方和输卵管妊娠滋养细胞共同作用48h后，不同剂量的中药复方均可明显降低滋养细胞的穿膜个数，各加药组与对照组比较均有统计学意义（P＜0.05）；与阳性对照组比较：1)中药2.5mg/mL组和甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，甲氨蝶呤优于中药2.5mg/mL组）；2)中药5mg/mL组和甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；3)中药10mg/mL组和甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，中药10mg/mL组优于甲氨蝶呤组）。
　　（6）化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡的影响：高、中、低不同剂量中药复方和输卵管妊娠滋养细胞共同作用48h后，就FASL来说，化瘀消癥杀胚中药复方高、中、低剂量组、甲氨蝶呤组与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），即无论是中药复方还是甲氨蝶呤均能显著增加 FASL的表达；与西药组相比，化瘀消癥杀胚复方高、中剂量组增加FASL表达的水平相比西药组（甲氨蝶呤）差异无统计学意义（P＞0.05），而化瘀消癥杀胚复方低剂量组FASL的表达水平明显低于甲氨蝶呤组（P＜0.05）；就 Caspase-3来说，其蛋白相对含量在各组的表达和FASL是一致的。
　　（7）化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞ER、PR m-RNA表达水平的影响：1)就ER来看，化瘀消癥杀胚中药复方高、中、低不同剂量组、甲氨蝶呤组与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05），即无论是中药复方还是甲氨蝶呤均能显著降低 ER的表达，且随着剂量的增高，其作用明显增强，呈剂量依赖的趋势；但与阳性对照组比较，化瘀消癥杀胚中药复方高、中、低剂量组降低 ER表达的水平均不及甲氨蝶呤组（P＜0.05）；2)就 PR来看，化瘀消癥杀胚中药复方高、中、低不同剂量组、甲氨蝶呤组与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05），即无论是中药复方还是甲氨蝶呤均能显著降低 PR的表达，且随着剂量的增高，其作用明显增强，呈剂量依赖的趋势；与阳性对照组比较，化瘀消癥杀胚中药复方中、低剂量组降低PR表达的水平均不及甲氨蝶呤组（P＜0.05），而化瘀消癥杀胚中药复方高剂量组降低PR表达的水平和甲氨蝶呤组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.本研究成功地建立了正常宫内早孕滋养细胞和输卵管妊娠滋养细胞体外培养模型，为后续实验提供了足够数量和质量的研究载体；
　　2.体外培养的输卵管妊娠与正常宫内早孕滋养细胞的生长周期大致相同；扫描电镜下二者外观形态无明显差异；二者侵袭能力亦无明显差异；
　　3.化瘀消癥杀胚中药复方可显著降低输卵管妊娠滋养细胞的侵袭能力，高剂量中药组甚至优于阳性对照组的效果，推断化瘀消癥杀胚中药复方降低输卵管妊娠滋养细胞的侵袭能力可能是避免其进一步浸润妊娠输卵管的机制之一；
　　4.化瘀消癥杀胚中药复方可显著增加输卵管妊娠滋养细胞凋亡相关蛋白 Fasl和caspase-3的表达，这为本课题前期研究成果“化瘀消癥杀胚中药复方可诱导滋养细胞凋亡”的理论提供了又一确切证据；化瘀消癥杀胚中药复方可能通过启动Fas/FasL系统凋亡通路最终完成了凋亡事件而在宏观上表现出“杀胚”效应；
　　5.化瘀消癥杀胚中药复方能显著降低输卵管妊娠滋养细胞 ER、PRm-RNA的表达，表明化瘀消癥杀胚中药复方能从性激素受体水平拮抗雌、孕激素，导致异位妊娠绒毛组织变性坏死，可能是它发挥消癥、杀胚功能的作用机理之一。

目录

声明

引言

第一部分 文献研究

第一节 异位妊娠发病概况与病因

第二节 异位妊娠病因病机和中医药治疗研究

第三节 中药干预异位妊娠的基础实验研究进展

第四节 人绒毛组织滋养层细胞体外培养方法研究进展

第五节 滋养细胞侵袭与凋亡生物学特性的研究

第二部分 实验研究

实验一 输卵管妊娠及正常宫内早孕滋养细胞的培养、分离、传代、鉴定及生长曲线的绘制

实验二 输卵管妊娠及正常宫内早孕滋养细胞形态学的扫描电镜观察

实验三 化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞超微结构影响的透射电镜观察

实验四 输卵管妊娠与正常宫内早孕滋养细胞侵袭能力的比较及化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞侵袭能力的影响

实验五 化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞凋亡能力的影响

实验六 化瘀消癥杀胚中药复方对输卵管妊娠滋养细胞ER、PR表达的影响

结语

一、创新点

二、结论

三、不足与展望

参考文献

附录

在学期间发表论文情况

致谢