温胆汤对自身免疫性脑脊髓炎树突状细胞及其介导炎性因子功能的作用

摘要

多发性硬化是一种常见的、不可预测的以中枢神经系统白质脱髓鞘为主要病理改变的神经系统炎性疾病，是在遗传易感的基础上，与环境因素共同作用发生的自身免疫性疾病。其发病率较高，呈慢性病程，倾向于青壮年罹患，肢体及认知功能可同时受损，致残率高，长期、严重影响患者的生活，带来巨大的经济和社会负担。据不完全统计，全球多发性硬化的患病人口约为250万。我国目前尚无确切的流行病学调查统计，但从文献研究及个案报道来看，多发性硬化在我国的发病率亦有逐渐上升的趋势。 目的: 本实验拟通过比较研究的方法，观察温胆汤对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠症状及病程改善、病理改变、免疫调节等方面的影响，探讨温胆汤在多发性硬化中的治疗机制及作用，为多发性硬化临床治疗做有益的探索。 方法: 1按随机原则把40只SPF级6-8周龄Wistar雌性大鼠分成正常组、模型组、西药组、中药组及中西药治疗组5组，每组8只。 2选用二次免疫法进行造模。 3在第1天注射免疫的同时给予灌胃。各组大鼠实验期间每间隔24小时连续16天给予灌胃。其中正常组大鼠给予正常生理盐水（2ml/只）灌服;模型组大鼠给予正常生理盐水（2ml/只）灌服;西药组大鼠给予醋酸泼尼松(1mg/kg)灌服;中药组大鼠给予温胆汤煎剂(11.88g/kg)灌服;中西药治疗组大鼠给予温胆汤煎剂(11.88g/kg)及醋酸泼尼松(1mg/kg)灌服。同时每间隔24小时连续16天观察各组大鼠的精神状态、饮水量、进食、体重等情况，并进行神经行为学评分。 4各组大鼠于第17天采用过度麻醉方法处死，并采集标本，进行组织病理、免疫组化检测TLR9的表达、ELISA检测IFN-γ及IL-2的含量、QPCR检查TLR2及TLR4的表达。 结果: 1正常组大鼠未出现临床症状;模型组大鼠于第2天开始陆续发病，第3天逐渐出现中枢神经系统受损症状，第10天达到发病高峰，发病率为8/8，死亡率为2/8;西药组大鼠于第2天开始陆续发病，第3天出现CNS受损症状，第12天达到发病高峰，发病率为8/8，死亡率为2/8;中药组大鼠于第2天陆续发病，第5天逐渐出现CNS受损症状，第13天达到发病高峰，发病率为8/8，死亡率为1/8;中西药治疗组大鼠其中6只于第5天开始陆续发病，第8天开始出现CNS受损症状，发病率为3/4，死亡率为0/8。 2治疗后各组临床症状神经功能评分比较，正常组无症状，模型组最高。与正常组比较，模型组、西药组、中药组、中西药治疗组差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较，西药组、中西药治疗组差异有统计学意义(P＜0.05);与西药组对比，中药组、中西药治疗组差异有统计学意义(P＜0.05);中药组与中西药治疗组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。 3治疗后各组潜伏期比较，正常组正常，模型组潜伏期最短，发病最快，中西药治疗组潜伏期最长，发病时间最慢。与模型组比较，中药组、中西药治疗组差异有统计学意义(P＜0.05);与西药组对比，中药组、中西药治疗组差异有统计学意义(P＜0.05);中西药治疗组与中药组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）;模型组与西药组差异无统计学意义（P＞0.05）。 4治疗后各组症状达高峰时间比较，正常组正常，模型组最快。中西药治疗组发病潜伏期长，取材时大鼠发病时间较短，故暂不讨论中西药治疗组症状达高峰时间。与模型组比较，西药组、中药组差异均有统计学意义(P＜0.05);中药组与西药组对比差异有统计学意义(P＜0.05)。 5正常组未发病;模型组、西药组、中药组所有大鼠均发病;中西药治疗组有6只大鼠发病。模型组及西药组均死亡2只大鼠;中药组死亡1只大鼠;正常组及中西药治疗组均未出现大鼠死亡。 6各组大鼠造模当天体重差异无统计学意义(P＞0.05)。造模后第10天、第16天各组大鼠体重比较，正常组最重，模型组及西药组最轻。与正常组比较，模型组、西药组、中药组、中西药治疗组差异均有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较，中药组、中西药治疗组差异有统计学意义(P＜0.05);与西药组对比，中药组、中西药治疗组差异有统计学意义(P＜0.05)，模型组与西药组对比差异无统计学意义(P＞0.05);中药组与中西药治疗组对比差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组、西药组、中药组、中西药治疗组大鼠体重第10天与第16天体重对比，差异有统计学意义(P＜0.05)，并且各组大鼠第16天体重大于第10天。 7 HE染色:正常组大鼠脑及脊髓未见异常。模型组脑和脊髓切片发现白质内可见小血管扩张，部分小血管壁增厚，血管周围有大量炎性细胞浸润，浸润细胞以淋巴细胞和中性粒细胞为主，形成“袖套”状改变。“袖套”状结构在脊髓白质及灰、白质交界处多见，炎性浸润主要分布在脊髓前脚白质、灰白质交界区及正中裂血管周围，并且炎性浸润部位及程度与临床症状密切相关，白质结构松散，呈空泡样改变，而脑实质则主要分布于脑室周围和白质内，灰质基本不受累。神经元细胞未见明显病变。西药组、中药组与模型组相比，“袖套”状结构均有所减少，血管周围炎性细胞明显减少，白质内见散在较多炎性细胞浸润。中西药治疗组脑及脊髓白质内“袖套”状结构明显减少，血管周围未见明显炎性细胞浸润，白质内散在炎性细胞浸润。 8脱髓鞘染色:正常组脊髓白质髓鞘染色呈均匀一致的蓝色，无脱髓鞘改变。模型组脊髓白质出现灶状或片状的髓鞘脱失，轴突肿胀甚至消失，蓝色髓鞘染色区域减少、颜色变浅，显示髓鞘脱失。西药组、中药组、中西药治疗组脱髓鞘减轻，蓝色髓鞘染色区域增多，以中西药治疗组减轻最为明显。 9免疫组化:TLR9阳性细胞中有棕黄色颗粒定位于胞浆、胞膜。正常组大鼠大脑皮质各层细胞，表层细胞如分子层、外颗粒层、外锥体细胞层基本无着色，表明其表达TLR9量很少;深层如内颗粒层、内锥体细胞层以星形细胞着色为主，也有锥体细胞，颜色均很淡，呈弱阳性。模型组大脑皮质的分子层、外颗粒层、外锥体细胞层和多形细胞层的TLR9表达量都比正常组明显增加。西药组、中药组大脑皮质的TLR9阳性细胞数量及阳性强度均较模型组有所降低。中西药治疗组大脑皮质的TRL-9阳性细胞面积及着色强度均较模型组显著下降。 10治疗后各组IL-2比较，模型组最高。与正常组比较，模型组差异有统计学意义（P＜0.05），西药组、中药组、中西药治疗组差异均无统计学意义（P＞0.05）。 11治疗后各组IFN-γ比较，模型组最高。与正常组比较，模型组差异有统计学意义(P＜0.05)，西药组、中药组、中西药治疗组差异均无统计学意义(P＞0.05)。 12治疗后各组TLR2比较，正常组最低，模型组最高。与正常组比较，模型组、西药组差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较，西药组、中药组、中西药治疗组差异有统计学意义(P＜0.05);正常组、中药组、中西药治疗组组间差异无统计学意义(P＞0.05)。 13治疗后各组TLR4比较，正常组最低，模型组最高。与正常组比较，模型组、中药组差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较，西药组、中药组、中西药治疗组差异均有统计学意义(P＜0.05)，正常组、西药组及中西药治疗组组间对比，差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论: 1 Wistar大鼠通过二次免疫法成功建立EAE模型。 2 EAE大鼠一般状况差，体重减轻，出现明显的神经系统受损症状。 3 EAE大鼠潜伏期短，出现临床症状后较快达高峰，中枢神经系统炎性细胞浸润、脱髓鞘改变，脑组织炎性细胞因子IL-2、IFN-γ产生增多，Toll样受体2、4、9表达增多。 4 EAE可能的机制是:在感染、外伤、缺血缺氧等条件刺激下，TLRs识别各种PMAs，促使细胞因子IL-2、IFN-γ等表达增加，使血脑屏障受损，炎性细胞和致炎性细胞因子如IL-2、IFN-γ进入CNS，进一步激活CNS内免疫细胞表达，从而加剧了炎症反应和脱髓鞘改变。 5温胆汤可降低EAE大鼠发病率及死亡率，延长其发病潜伏期及临床症状达高峰时间，同时减轻高峰期临床症状，减轻脑脊髓炎症细胞浸润，减轻脱髓鞘病变，说明温胆汤对EAE大鼠发病具有防治作用。 6温胆汤可减少EAE大鼠IL-2与IFN-γ mRNA的表达。 7温胆汤可降低EAE大鼠脑组织TLR2、4、9的表达。 8温胆汤可抑制DC Toll样受体的抗原提呈作用，通过抑制Th1细胞增殖、抑制Th1细胞分泌炎性细胞因子，从多个环节上抑制EAE异常的细胞免疫应答过程，抑制了体内的细胞毒性T细胞、NK、单核细胞、巨噬细胞、B细胞等的激活，调节炎性细胞介质的表达和活化，打破了炎症得以放大和持续的正反馈环路，从而抑制和逆转EAE的发生及发展。 9联用温胆汤和醋酸泼尼松治疗EAE疗效更佳。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 文献研究

1．1 多发性硬化的现代医学研究进展

1．1．1 流行病学

1．1．2 临床表现

1．1．3 病因

1．1．4 发病机制

1．1．5 病理学特征

1．2 中医学对多发性硬化的认识

1．2．1 病名

1．2．2 病因病机

1．2．4 温胆汤

第二部分 实验研究

2．1 实验目的

2．2 实验材料

2．2．1 实验动物

2．2．2 实验主要仪器及器材

2．2．3 实验药物及试剂

2．3 实验动物饲养条件

2．4 实验方法

2．4．1 分组及免疫

2．4．2 标本采集

2．4．3 观察指标

2．5 统计学分析

2．6 结果

2．6．1 基本情况、症状及体征观察

2．6．2 组织观察

2．6．3 IL-2、IFN-γ、TLR2及TLR4的测定

第三部分 讨论

3．1 实验模型的选择

3．2 温胆汤选择依据

3．3 激素选择依据

3．4 实验指标的选择

3．4．1 行为学及形态学交化

3．4．2 Th1型细胞因子

3．4．3 树突状细胞

结语

参考文献

附录

课题来源

在校期间发表论文情况

致谢