乌头汤总生物碱对HFLS增殖影响及提取纯化工艺研究

摘要

研究背景与目的: 乌头汤源于东汉时期著名中医学家张仲景所编写的《金匮要略》，药方组成有:川乌、麻黄、芍药、黄芪、炙甘草五味药材。该方主要治疗关节疼痛，不可屈伸，素体寒湿的痹证，这与现代的类风湿性关节炎、关节炎等疾病症状相符。乌头汤在经历数代中医名家适时改革创新，加减配伍药物后衍生出许多新药方，如现代的李氏改良乌头汤、陈邦兴的细辛乌头汤、毛丽珠的二藤乌头汤等。但归其根源，张仲景所创乌头汤仍是上述方剂配伍的主要组成，并在临床治疗应用中得到肯定。 本研究是在课题组前期已开展的配伍减毒实验和谱效学研究的基础上，通过乌头汤总生物碱与乌头汤中其他成分对人类风湿关节炎滑膜细胞(HFLS)的增殖影响进行比较研究，进一步研究君药制川乌与臣药麻黄的总生物碱部位的抗炎作用。研究证实，总生物碱部位对HFLS有较好的增殖抑制作用，提示该部位对类风湿关节炎起一定的炎症抑制作用。在此基础上我们继续开展了生物碱部位的提取纯化及特征图谱研究，为课题后续深入研究提供参考。 方法: 本研究利用体外培养HFLS，采用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)，比较乌头汤总生物碱部位与其他成分对HFLS的增殖抑制作用。设计7个给药组进行实验:乌头汤总生物碱组、盐酸麻黄碱组、芍药苷组、甘草苷组、甘草酸铵组、乌头碱组、黄芪甲苷组，并对各组细胞增殖抑制率进行统计分析。 分析发现，乌头汤的总生物碱部位有较好的细胞增殖抑制作用，因此，以总生物碱、盐酸麻黄碱、单酯型乌头碱的含量为考察指标，从提取溶剂浓度、溶剂量、时间、次数这4个因素，考察乌头汤中总生物碱部位最佳提取工艺。同时，通过正交试验，从树脂型号筛选、洗脱剂浓度和用量、上样条件，考察乌头汤中总生物碱部位最佳纯化工艺。此外，还利用HPLC法对总生物碱部位的特征图谱进行分析。 成果: 经过初步的体外细胞药效筛选研究，结果表明乌头汤中盐酸麻黄碱(202.00～808.00μg/ml)、总生物碱部位(3.00～12.00 mg/ml)、芍药苷(1.20～24.00 mg/ml)、甘草苷(26.00～400.00μg/ml)对HFLS的增殖在一定浓度范围内具有明显的抑制效果，并显示剂量依赖性;其中，盐酸麻黄碱给药浓度低，但细胞增殖抑制作用显著，且有效浓度范围窄;总生物碱部位抑制作用明显，作用与盐酸麻黄碱相似但稍弱;乌头碱、甘草酸铵、黄芪甲苷在实验浓度范围内的抑制作用不明显。在总生物碱提取纯化的实验考察中，确立的最佳提取工艺条件为:10倍量85％乙醇（含0.1mol/L盐酸），水浴回流提取2次，每次2h;最佳纯化工艺条件为:D101大孔树脂，药材量∶树脂量(V∶V)=1∶3，树脂柱径高比1∶12，上样药液浓度0.5 g/m1（生药量），上样流速3.0 mL/min，7倍量50％乙醇洗脱。采用HPLC法成功绘制出总生物碱部位的HPLC特征图谱，初步建立HPLC谱图分析条件。 结论: 乌头汤中总生物碱部位、盐酸麻黄碱、芍药苷、甘草苷可抑制HFLS的增殖，其中以盐酸麻黄碱、总生物碱部位较明显。乌头碱、甘草酸铵、黄芪甲苷的细胞增殖抑制作用不明显，推测可能与药物水溶性及作用机制有关。总生物碱提取纯化工艺简便可行。初步建立的总生物碱HPLC特征图谱方法可行。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 文献研究

第一章 乌头汤与类风湿关节炎的研究背景

1 RA的临床表现

2 RA的关节组织变化

3 RA病机的研究

4 RA的治疗与用药

第二章 乌头汤的主要药效成分及与RA治疗相关研究

1 乌头类生物碱

2 芍药苷

3 麻黄碱

4 黄芪皂苷

5 甘草酸、甘草苷

第三章 川乌和麻黄生物碱的提取纯化的研究概况

1 提取工艺研究

2 纯化工艺研究

3 存在问题与提示

第二部分 实验研究

第一章 乌头汤有效成分对人滑膜成纤维细胞的增殖影响研究

1 实验材料与设备

2 实验方法

3 统计学处理

4 实验结果

5 讨论

第二章 乌头汤总生物碱含量测定方法研究

1 总生物碱含量测定方法建立

2 盐酸麻黄碱与单酯型乌头碱HPLC含量测定方法建立

3 讨论

第三章 乌头汤总生物碱提取分离工艺研究

1 总生物碱提取工艺考察

2 总生物碱初步分离工艺考察

3 讨论

第四章 乌头汤总生物碱HPLC特征图谱方法初探

1 仪器与试药

2 对照品制备

3 供试品溶液的制备

4 色谱条件考察

5 讨论

第五章 乌头汤生物碱对HFLS增殖影响研究

1 仪器与试药

2 盐酸麻黄碱、总生物碱对HFLS增殖影响的比较

3 讨论

第六章 结语

1 实验总结及讨论

2 展望

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢