单核细胞在PBC中的表型特征及其对CD4+T分化的研究

摘要

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是以肝内小胆管炎症、破坏为特征的慢性、进行性胆汁淤积性的自身免疫性肝脏疾病。虽然具体发病原因不清楚，但与免疫因素密切相关，广泛的单核/巨噬细胞浸润及CD4+T细胞异常活化是PBC中小胆管损伤、肝纤维化及PBC炎症持续的重要原因，但机制未明。单核细胞(monocyte，Mo)不仅是重要的固有免疫应答细胞，而且通过呈递抗原、分泌细胞因子等调节适应性免疫应答。研究显示Mo是一异质性群体，根据其表面CD16分子的表达，分为CD16-Mo亚群和CD16+Mo亚群，后者根据CD14分子表达的强弱进一步划分为CD14highCD16+Mo亚群和CD14dimCD16+Mo亚群。相较于CD16-Mo，CD16+Mo高表达HLA-DR、共刺激分子及粘附分子等，分泌更多的促炎因子，因此也称为炎症性Mo。新近研究显示炎症性Mo在感染和某些自身免疫性疾病中表达异常，并且在其致病中发挥重要作用，而越来越引起关注。但是炎症性单核细胞亚群在PBC中是否表达异常及参与发病尚未见报道，因此，本论文首先分析PBC患者外周血单核细胞亚群的免疫表型与比例，并探讨其与临床实验指标的相关性;此外通过Mo与CD4+T细胞共培养体系，进一步深入研究其调控CD4+T细胞分化的机制，为寻找治疗新靶点及阐明PBC致病机制提供科学的实验依据。 目的: 本研究拟以PBC患者外周血中单核细胞亚群免疫表型特征为出发点，首先分析炎症性单核细胞亚群与PBC的实验室血清学指标之间的相关性;进一步研究PBC患者外周血中炎症性单核细胞亚群对CD4+T细胞分化的影响。 方法: 1.分离PBC患者与对照组外周血单个核细胞PBMCs，流式细胞术检测单核细胞表型及比例; 2.全自动生化仪检测PBC患者外周血肝功能指标(腺苷脱氨酶ADA，谷丙转氨酶ALT，谷草转氨酶AST，γ-谷氨酰转肽酶GGT，碱性磷酸酶ALP)和炎症指标（C反应蛋白CRP），并进一步与Mo亚群进行Pearson相关分析; 3.胞内细胞因子染色，流式细胞术检测PBC患者外周血Th1/Th17细胞比例，并进一步与Mo亚群进行Pearson相关分析; 4.磁珠分选PBC患者外周血CD16-Mo亚群和CD16+Mo亚群，并分别与CD4+T细胞共培养和transwell实验，流式细胞术检测PBC患者外周血Th1/Th17细胞比例; 5.RT-PCR检测Mo亚群中IL-12p35、IL-12p40和IL-18基因表达水平;在CD4+T细胞与Mo亚群共培养体系中加入抗体阻断剂，流式细胞术检测Th1细胞比例。 结果: 1.相较HC组，PBC患者组CD14highCD16+Mo和CD14dimCD16+ Mo亚群表达上调[PBCCD14highCD16+Mo(11.59±5.39)％、HC CD14highCD16+Mo(5.86±1.83)％,PBC CD14dimCD16+Mo(15.84±5.34)％、HC CD14dimCD16+ Mo(4.68±2.10)％（P均＜0.05)]，相较CHB组，CD14dimCD16+Mo亚群表达上调[(15.84±5.34)％、(6.16±2.22)％(P＜0.05)]; 2.PBC患者CD14dimCD16+Mo亚群细胞与ADA(r=0.582，P＜0.01)及炎症活动指标CRP水平(r=0.629，P＜0.01)呈正相关，与ALT，AST，GGT和ALP均不相关（P＞0.05）; 3.PBC患者外周血CD16+Mo亚群与Th1细胞呈正相关(r=0.545，P＜0.01)，与Th17细胞不相关（P＞0.05）; 4.CD16+Mo与CD4+T共培养体系相较CD14highCD16-Mo与CD4+T共培养体系，Th1细胞比例增高[(19.43±1.57)％、(14.42±2.37)％(P＜0.05)]，而Th17细胞比例无变化[(0.52±0.56)％、(0.44±0.47)％（P＞0.05）]; 5.CD16+Mo与CD4+T直接接触相对不接触，Th1细胞比例增高[(18.42±3.87)％，(10.53±3.48)％(P＜0.05)]; 6.CD16+Mo相较CD16-Mo高表达IL-12p40，用IL-12p40阻断剂阻断后Th1细胞比例显著降低（P＜0.05）。 结论: 1.PBC患者外周血CD14highCD16+Mo和CD14dimCD16+Mo亚群表达上调，并且CD14dimCD16+Mo亚群与ADA、CRP呈正相关; 2.炎症性单核细胞亚群通过细胞-细胞接触和分泌IL-12促进Th1细胞分化。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献综述

1．1 PBC发病机制的研究

1．1．1 适应性免疫

1．1．2 固有免疫

1．2 Mo对PBC的意义

1．2．1 Mo的表型和功能

1．2．2 Mo在免疫性疾病中的作用

1．2．3 Mo在肝脏疾病中的作用

1．2．4 Mo在PBC中的作用

1．3 PBC的诊断

1．4 PBC的治疗

第二章 PBC患者外周血炎症单核细胞表达特点

2．1 材料

2．1．1 研究对象

2．1．2 纳入标准

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分离

2．2．2 流式细胞术检测单核细胞分类

2．2．3 统计学处理

2．3 结果

2．3．1 PBC患者外周血中CD16+Mo显著增加

2．3．2 PBC患者外周血中CD16+Mo与实验室血清学指标ADA呈正相关

2．3．3 PBC患者外周血中CD16+Mo与CRP呈正相关

2．4 讨论

第三章 PBC患者炎症性单核细胞亚群调控CD4+T细胞分化机制的研究

3．1 材料

3．1．1 研究对象

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 流式细胞术检测淋巴细胞分类

3．2．2 分选CD16+Mo

3．2．3 分选CD14highCD16-Mo

3．2．4 T细胞的培养和刺激

3．2．5 Transwell实验

3．2．6 细胞总RNA的抽提

3．2．7 cDNA的合成

3．2．8 引物的设计与合成

3．2．9 PCR表达的检测

3．2．10 抗体阻断实验

3．2．11 统计学处理

3．3 结果

3．3．1 PBC患者外周血中CD4+T细胞中Th1、Th17显著扩增

3．3．2 PBC患者外周血中Th1％与CD16Mo％呈正相关性

3．3．3 CD16+Mo促使CD4+T向Th1细胞分化

3．3．4 CD16+Mo通过直接接触促使CD4+T向Th1细胞分化

3．3．5 CD16+Mo通过分泌IL-12p40调控CD4+T向Th1细胞分化

3．4 讨论

结语

研究结论

创新点

实验不足和后续展望

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢