七厘散促组织工程皮肤修复创面及龙血素A对毛囊干细胞Wnt/β-catenin信号通路的调控

摘要

目的：建立高效稳定的大鼠毛囊干细胞(hair follicle stem cells，FSCs)和毛囊成纤维细胞原代取材、分离、培养方法，并对所得细胞进行鉴定。制备七厘散含药血清，将七厘散含药血清加入FSC培养体系中，明确其对FSC增殖的促进作用。选用皮耐克作为组织工程皮肤支架，将毛囊成纤维细胞与皮耐克支架复合构建人工真皮，再将FSC与人工真皮共培养，构建组织工程皮肤。制作裸鼠全层皮肤缺损模型，将构建的组织工程皮肤移植入皮肤创面，探讨七厘散对FSC组织工程皮肤修复创面的影响。由于七厘散复方药物成分复杂，为了进一步探讨中药有效成分在FSC修复皮肤创面中的作用机理，本研究选用七厘散中君药血竭的主要活性成分----龙血素A单体干预FSC，探讨其对FSC生长及细胞周期的影响，并进一步检测Wnt/β-catenin信号通路中主要蛋白和下游基因表达的变化，初步探讨龙血素A对FSC增殖或定向分化的分子机制。
　　方法：采用“两步酶”消化法获取乳鼠触须部皮肤FSC，毛囊成纤维细胞采用组织块法培养，免疫荧光检测培养的FSC中角蛋白15(cytokeratin15，CK15)、角蛋白19(cytokeratin19，CK19)、β1整合素的表达以及毛囊成纤维细胞中纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、层粘连蛋白(laminin，LN)、波形蛋白(Vimentin)的表达。严格遵循“通法”制备大鼠七厘散含药血清。噻唑蓝(3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法探究不同时间点、不同体积百分比七厘散含药血清作用于FSC后的细胞活性。将毛囊成纤维细胞接种于皮耐克真皮支架构建真皮，表面种植5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)标记的FSC，Transwell双层培养板进行气-液界面培养，构建FSC组织工程皮肤。制作裸鼠背部皮肤缺损模型后将动物随机分为A、B组，A组用生理盐水预处理创面，B组用七厘散预处理创面，然后各动物创面均移植构建的FSC组织工程皮肤。移植后再将每组动物随机分为5小组，分别对移植处创面进行生理盐水、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)阳性药物、七厘散内服、七厘散外用、七厘散内服+外用方式处理。每日观察并记录创面大体愈合情况，制订评分标准，统计得分。于移植后3d、5d、7d、14d在原创面处取材，标本作病理学和免疫荧光组织化学检测。MTT法探究不同时间点、不同浓度龙血素A对FSC增殖的影响。流式细胞仪检测龙血素A对FSC细胞周期的影响。Western Blot、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)技术对龙血素A干预的FSC胞质内β-catenin、糖原合成激酶（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）蛋白以及核内转录因子3(transcription factor3，Tcf3)、淋巴增强因子1(lymphoid enhancerfactor，Lef1)、c-myc、cyclin D1基因的表达进行检测。
　　结果：“两步酶”法分离、培养的细胞为圆形或多角形，典型铺路石状，呈CK15、CK19、β1整合素表达阳性;组织块法获得的细胞为纺锤形，FN、LN、Vimentin表达阳性。连续灌胃3d、体积百分比为2.5％的七厘散含药血清作用于FSC24h的促增殖效果最佳。毛囊成纤维细胞与皮耐克复合，连续培养5d，构建的真皮无污染，细胞生长良好。将FSC与人工真皮复合后继续培养5d，再进行气-液界面培养5d后，得到的人工皮肤复合物质地柔软，有一定的韧性和弹性。FSC组织工程皮肤移植后，各组动物生存状态良好，创面无感染、出血，移植物无脱落，亦无明显的免疫排斥反应。术后3d创面逐渐缩小，血痂形成。术后5d血痂逐渐变硬，变厚。术后7d痂面面积慢慢变小，痂面周缘可见新生皮肤。术后14d大部分裸鼠血痂脱落，其中A、B两组中七厘散外用组和七厘散内服+外用组血痂脱落较其余组早。术后14d，A、B两组中七厘散外用组和七厘散内服+外用组裸鼠创面已上皮化，移植处新生皮肤较厚，质地柔软，呈白色或粉肤色，可与正常皮肤相区别。通过观察创面愈合情况，制订评分标准，半定量统计结果显示术后3d，A、B两组平均得分差异有统计学意义，表明七厘散预处理创面在愈合早期能抑制创面出血、减轻炎症反应、促进创面结痂，对促进创面修复有积极作用;A、B两组各用药组与生理盐水对照组相比，差异有统计学意义，说明在移植后早期，不同的用药方式对伤口的愈合有影响。术后5d，创面进入修复期，两组修复状况无明显差别。术后7d和14d，A、B两组平均得分差异均有统计学意义，其中B组七厘散外用组、七厘散内服+外用组平均得分最高，显示外用和内服+外用为七厘散最佳用药方式。病理学结果显示，术后3d各组炎性反应明显，创面有血痂覆盖，可见未降解的皮耐克支架与大量淋巴细胞，七厘散外用组创面细胞增多密集。术后5d各组炎症反应减轻，各组表皮细胞开始增生，但未完全覆盖创而，新生上皮与真皮连接不紧密，容易分离，B组肉芽组织增生明显。术后7d各组炎症反应明显减轻，胶原纤维增多，创缘可见较厚新生表皮。术后14d各组未见明显支架材料，A、B两组中生理盐水对照组和七厘散内服组有少量创面未愈合，其余各组创面均愈合，表皮和真皮分层明显，分化良好。免疫荧光检测显示，术后各组中BrdU标记的FSC呈CK15、 CK19和β1整合素阳性表达，随着移植时间的延长，各组标本中角蛋白14(cytokeratin14，CK14)的表达均逐渐增多增强。MTT结果显示20μg/mL龙血素A作用于FSC24h的促增殖效果最佳，流式细胞术分析发现，龙血素A作用后，S期和G2期细胞数量增加，龙血素A促进细胞向S期和G2期转变。龙血素A干预FSC后，Wnt经典通路中GSK-3β表达减少，β-catenin表达增多，核内Tcf3、Lefl、c-myc和cyclin D1基因的mRNA表达均上调。
　　结论：七厘散含药血清能促进FSC的增殖。七厘散通过“祛瘀生肌”，改善创面微环境，促进FSC组织工程皮肤修复全层皮肤缺损，植入的FSC参与新生表皮的形成。龙血素A通过激活Wnt/β-catenin信号通路，改变FSC细胞周期，进而促进FSC增殖和分化。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

第一节 组织工程皮肤的研究进展

一、组织工程皮肤简介

二、组织工程皮肤支架的选择

三、组织工程皮肤种子细胞的研究背景

第二节 中医药治疗皮肤缺损的研究进展

一、中医药治疗皮肤缺损的现代研究

二、中医药对组织工程皮肤修复皮肤缺损的影响

第三节 FSC和Wnt／β-catenin信号通路的研究进展

一、FSC的研究进展

二、Wnt／β-catenin信号通路的研究概况

三、Wnt／β-catenin信号通路对FSC的作用

四、七厘散含药血清促进FSC增殖的可能性

五、龙血素A激活FSC Wnt／β-catenin信号通路的可能性

第二章 实验研究

第一节 大鼠FSC、毛囊成纤维细胞的原代取材、培养和鉴定

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第二节 七厘散含药血清对FSC的作用及FSC组织工程皮肤的构建

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第三节 七厘散对FSC组织工程皮肤修复皮肤缺损的影响

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第四节 龙血素A对FSC Wnt／β-catenin信号通路的调控

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢