从T细胞角度探讨广藿香酮对炎症性肠病的免疫调节作用

摘要

研究目的
　　炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一种病因未明的慢性肠道免疫性疾病。一般认为IBD的发生是环境因素作用于遗传易感者，在肠道菌群的参与下，启动了肠道免疫及非免疫系统，最终导致自身免疫性炎症反应。其中，IBD的自身免疫性特点与T细胞免疫应答密切相关，特别是肠道粘膜上Th细胞亚群失衡。因此，从调节T细胞亚群失衡角度，尤其是Th细胞亚群，深入了解IBD多因素多靶点的发病机制，对进一步阐明IBD的免疫发生机制有重要意义。
　　广藿香是治疗暑湿蕴结诱发的胃肠疾患的岭南道地药材，具芳香化浊、开胃止呕、发表解暑的功效。广藿香酮(Pogostone，PO)是广藿香的主要有效成分。本课题组前期研究证实，广藿香的挥发油成分可明显缓解三硝基苯磺酸(2，4，6-Trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)诱导的IBD症状。因此，本论文拟从调节T细胞亚群平衡角度，观察广藿香酮对IBD的治疗作用，并对其作用机制进行初步探讨，不仅有助于进一步认识IBD的免疫发生机制，更为科学阐释广藿香药效物质基础的科学内涵提供依据。
　　方法
　　1.广藿香酮对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导IBD的治疗作用
　　1)取雄性SD大鼠，设正常组(Normal)，模型组(Model)，柳氮磺吡啶组(SASP，200mg/Kg)，广藿香酮组(PO，20，40，80mg/Kg)。除Normal组外，其余各组通过直肠灌注TNBS(25mg/Kg)制备IBD模型。从造模当天开始，各组动物连续7天灌肠给予相应药物，正常组及模型组给予等体积药物溶剂;
　　2)以体重变化、粪便性状、血便/便血情况建立疾病活动指数(DiseaseActivity Index，DAI)评分体系，评价动物。于实验第8天，剖取各组大鼠肛门至盲肠段结肠，对大鼠结肠组织炎症作大体评分(Macroscopic score，MS)。结合DAI和MS评分结果，在PO实验组中选择效果最优剂量组的样品进行以下实验;
　　3)所得结肠的病变部位(距肛门端约8cm)，部分通过苏木素/伊红(hematoxylin-Eosin，H&E)染色法，进行病理组织学评分(histological score，HS)，同时通过免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)检测，分析CD4、叉头框蛋白P3(Foxp3)、IFN-γ、IL-17表达情况。此外，部分组织用于检测组织中髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性变化;应用酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)检测组织中转化生长因子-β(TGF-B)含量，同时应用液态悬浮芯片技术检测组织中白介素-17A(IL-17A)，IL-10，IL-4，IL-12p70，γ-干扰素(IFN-γ)含量;
　　4)应用流式细胞术检测大鼠肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes，MLN)中辅助性T细胞(helper T cell，Th)中IFN-γ、IL-4、IL-17和Foxp3表达率，分析Th1、Th2、Th17，以及调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)比例;同时检测其中的Ki67、CD38/MHCⅡ表达率，以分析MLN中Th细胞的增殖和激活状态;
　　5)应用荧光定量聚合酶链式反应技术(quantitative Realtime PolymeraseChain Reaction，quantitative rt-PCR)，分析结肠组织和MLN中转录因子(Transcriptfator, TF)T-bet, STAT1、GATA3、STAT6、STAT3、RORγt、Foxp3的mRNA相对表达量。
　　2.广藿香酮对刀豆蛋白A(ConcanavalinA，ConA)诱导的T细胞增殖的抑制作用
　　1)广藿香酮与未刺激的C57BL/6小鼠脾淋巴细胞共孵育48h和72h后，应用MTS细胞增殖试剂盒测定脾细胞的相对存活率，分析广藿香酮(5～80μM)的安全浓度;
　　2)以终浓度为1μg/mL的ConA为刺激剂建立T细胞增殖模型，以广藿香酮(20，40，80μM)干预72h。应用流式细胞术，以Anti-CD3、Anti-CD4、Anti-CD8抗体标记T细胞、CFSE标记法分析受刺激T细胞及其亚群的增殖情况;以AnnexinⅤ标记法分析受刺激T细胞的凋亡情况;以AnnexinⅤ/碘化吡啶(PI)双标记法分析其周期分布情况。此外，以Anti-CD3抗体标记T细胞，通过胞内蛋白标记法分析ConA刺激后T细胞中CDK2、CyclinE、CDK1、Cyclin B的表达情况;
　　3)以流式微球阵列分析法(Cytometry Beads Array，CBA)分析细胞上清液中IL-6，IL-10，单细胞趋化因子蛋白-1(Monocyte chemotactic protein，MCP-1)，IFN-γ，以及肿瘤坏死因子(Tumor nerosis factor，TNF)的分泌。
　　结果
　　1.广藿香酮对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导IBD的治疗作用
　　1)在25mg/KgTNBS刺激下，模型组大鼠与正常组相比，出现体重明显下降、稀便、血便等典型的IBD体征，伴有明显的肠粘连、溃疡/坏死严重、肠壁水肿增厚明显等结肠病变。HE染色显示模型组大鼠结肠黏膜出现明显的透壁性炎症，包括溃疡、隐窝变型，黏膜及黏膜下层可见大量炎性细胞浸润，肌层肥大增厚，伴有血管增生。组织中MPO活性明显升高进一步说明了模型组结肠组织出现严重的炎症浸润。相比之下，广藿香酮可明显提高IBD模型动物的生存质量，使其粪便性状逐渐恢复正常，并防止血便发生，DAI评分明显低于模型组;同时，广藿香酮组(40mg/Kg)的MS和HS均明显低于Model组，广藿香酮可减轻结肠水肿、溃疡、坏死，降低组织中MPO活性，其中广藿香酮(40mg/Kg)效果最优。HE染色结果表明广藿香酮(40mg/Kg)可促进结肠黏膜愈合，减少溃疡面积，促进隐窝形态恢复正常，减少炎性细胞浸润，使肌层变薄，说明广藿香酮可有效缓解IBD的肠道炎症反应。细胞因子谱分析结果表明，模型组大鼠结肠组织中IL-4、IL-12p70、IL-10、IL-17、TGF-β含量明显高于正常组，而广藿香酮(40mg/Kg)则可抑制IFN-γ、IL-12p70、IL-17、IL-10的分泌。此外，免疫组化分析结果表明，模型组大鼠结肠组织中CD4、IFN-γ、IL-17、Foxp3的表达明显高于正常组，提示模型组大鼠结肠组织出现明显的Th细胞浸润;与此相比，广藿香酮(40mg/Kg)可明显抑制组织中CD4、IFN-γ、 IL-17的表达，减少Th细胞，尤其是Th1、Th17细胞在病变黏膜中的浸润。Th细胞转录因子mRNA相对表达量分析表明，模型组动物组织中T-bet、GATA3、STAT6、Foxp3的相对表达量明显高于正常组，RORγt的表达量则明显低于正常组;而广藿香酮(40mg/Kg)对1BD模型动物组织中相应转录因子的mRNA相对表达影响较小，仅使RORγt明显提高至接近正常组。
　　2)针对MLN的分析表明，模型组大鼠MLN中Th细胞的Ki67阳性率、CD38/MHC-Ⅱ共阳性率与正常组比较无明显差别，广藿香酮(40mg/Kg)对此也无明显影响;同时，模型组大鼠MLN中Th细胞的IFN-γ、IL-17、Foxp3表达率与正常组比较无明显差异，而IL-4表达率则明显升高;而广藿香酮(40mg/Kg)对MLN中Th细胞的IFN-γ、IL-4、IL-17、Foxp3的表达率无明显影响。针对MLN中Th细胞转录因子的mRNA相对表达量分析结果表明，与正常组比较，模型组大鼠MLN中GATA3表达明显下调的同时RORγt明显上升，而T-bet、STAT6、STAT3、Foxp3则无明显变化;广藿香酮(40mg/Kg)使上述转录因子的mRNA表达恢复至接近正常组水平，其中使Foxp3的相对表达量与模型组有统计学差异。结果提示在本条件下，IBD模型动物MLN中Th细胞的激活、增殖状态，及各亚群的分化状态无明显变化，广藿香酮(40mg/Kg)对MLN中Th的上述指标也无明显影响。
　　2.广藿香酮对刀豆蛋白A诱导的T细胞增殖的抑制作用
　　1)结果表明，0～80μM广藿香酮对正常脾细胞的相对活力无影响，说明广藿香酮在该浓度范围内对淋巴细胞无毒性作用。在ConA诱导T细胞增殖模型中，由于“激活诱导的细胞死亡(AICD，Activation Induced Cell Death)”效应的存在，脾淋巴细胞出现了轻微凋亡，同时T细胞的增殖比例，及其在脾淋巴细胞中的比例明显升高。而广藿香酮(20，40，80μM)在不引起细胞毒性或凋亡的情况下，可明显降低T细胞的增殖比例及其细胞比例，说明广藿香酮可直接抑制ConA诱导的T细胞增殖，且进一步分析表明PO对Th中的CD4+T细胞和CD8+T细胞同样有直接增殖抑制作用。
　　2)细胞周期分析结果表明，广藿香酮直接的增殖抑制活性可能与其诱导周期阻滞作用有关。ConA刺激后，处于S期和G2/M期的淋巴细胞比例明显增加，且进一步分析表明与S期的周期调控蛋白CDK2表达明显下降，而cyclin E，以及与G2/M相关的CDK1、cyclinB均明显增加。相比之下，广藿香酮(20，40，80μM)使S期和G2/M期的T细胞比例明显下降，同时明显减少cyclin E、CDK1、cyclinB的表达。上述结果提示，广藿香酮可通过抑制增殖细胞中CDK1和CyclinB的表达，阻碍G2/M期检查点行使功能，从而使已处于增殖状态下的T细胞无法进入G2/M期，发生S期停滞，最终直接抑制了T细胞增殖。
　　3)此外，细胞因子谱分析表明，ConA刺激可使脾淋巴细胞的IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF的分泌量显著增加，而广藿香酮(20，40，80μM)则可明显抑制其中的促炎因子IFN-γ和抗炎因子IL-10的分泌。
　　结论
　　广藿香酮可明显改善IBD模型动物的生存质量，缓解IBD的肠道炎症反应，减轻结肠水肿、溃疡、坏死，减少病变黏膜中炎症细胞浸润，促进黏膜愈合，说明广藿香酮对IBD具有一定的治疗作用。体外实验结果进一步提示，广藿香酮的对IBD的治疗作用可能与其直接的免疫抑制作用有关。广藿香酮可通过诱导处于增殖状态的T细胞发生S期阻滞，对T细胞产生直接的增殖抑制作用，减少致炎性Th细胞Th1、Th2、Th17和免疫抑制性的Treg在病变黏膜中的浸润，从而减少促炎因子和抗炎因子的分泌，调节细胞因子网络平衡，最终钝化适应性免疫应答，全面抑制IBD发展过程中的攻击性免疫反应。上述实验结果提示，广藿香的特征性成分广藿香酮对实验性IBD模型具有明显的治疗作用，该作用与其直接抑制T细胞增殖、缓解IBD活动期间适应性炎症反应密切相关，提示广藿香在IBD治疗中有潜在的应用价值。

目录

声明

摘要

前言

第一章 文献研究

一、广藿香研究概况

二、广藿香酮的研究进展

三、IBD研究进展

四、IBD与辅助性T细胞的关系

第二章 实验研究

第一节 广藿香酮对TNBS诱导炎症性肠病的治疗作用

一、仪器

二、动物

三、试剂

四、方法

五、结果

六、讨论

第二节 PO对刀豆蛋白诱导的T淋巴细胞增殖的抑制作用

一、仪器

二、动物

三、试剂

四、方法

五、结果

六、讨论

结语

一、结论

二、展望

参考文献

附录 缩略词表

在校期间发表论文、著作及学术报告

致谢

附件1：统计学处理合格证明