冰香散抗流感病毒作用及机制研究

摘要

目的:
　　通过检测鼠流感Th1/Th2免疫因子及气管粘膜TLR2/4mRNA、MYD88mRNA的表达变化，探讨冰香散挥发油制剂对流感病毒的防治作用及其免疫调节机制，并根据前期对冰香散大量的研究，通过鸡胚实验初步探讨具体药效学基础物质。
　　方法:
　　一、挥发油的提取用水蒸气蒸馏法提取实验所用的挥发油制剂，提取工艺为将药材粉碎成中粉，加10倍量的水浸泡1.5小时，通过水煮蒸馏的方法提取6小时。
　　二、鼠流感病毒动物模型的建立、取材选用BALB/c小鼠，随机分为正常组、病毒对照组、利巴韦林组、冰香散挥发油制剂滴鼻组、冰香散挥发油制剂雾化组，采用不同的给药方式预防性给药7d，第8天以15LD50攻毒，再持续给药5天后取材。取肺行肺组织病理学检查观察病变;取脾脏、气管置于生理盐水中洗去血液，离体后30min内速冷冻保存于液氮中待用。
　　三、脾淋巴细胞分泌的细胞因子RT-PCR检测:异硫氰酸胍一步法提取小鼠脾脏组织总RNA，分光光度计法定量。根据细胞因子IFN-γ、IL-4和β-actin的eDNA序列，分别设计上游和下游引物。取2ug总RNA加入AMV反转录酶进行反转录，以TaqDNA聚合酶进行PCR，扩增参数为94℃30s，60℃45s，72℃60s，循环30次。以2％琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。
　　四、气管粘膜TLR2/TLR4、MYD88 Real-time PCR检测:取100mg气管粘膜，trizol法提取总RNA，经紫外分光光度计定量后，核酸蛋白紫外分析仪检测RNA的浓度，要求A260/A280在118-210，并调整RNA浓度至1mg/L。取1μg RNA，M-MuLV反转录酶逆转录合成cDNA。在Step One QPCR仪上用SYBR GreenⅠ荧光染料技术行实时定量PCR反应。UDG2min，95℃预变性2min，设计循环程序:95℃变性15s，62.5℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。每个样品分析三次，反应结束后做熔解曲线以验证PCR产物的特异性。实时荧光定量PCR结果分析采用2-△△Ct分析法。
　　五、药物最大无毒剂量(TD0)的测定实验设有空白对照组、溶剂对照组、利巴韦林注射液组、广藿香挥发油组、艾叶挥发油组，冰片组。利巴韦林注射液的给药剂量分别为10mg/胚、5mg/胚、2.5mg/胚、1.25mg/胚、0.625mg/胚;广藿香挥发油组药剂量分别为20mg/胚、15mg/胚、10mg/胚、5mg/胚、2.5mg/胚;艾叶挥发油组的给药剂量为20mg/胚、15mg/胚、10mg/胚、5mg/胚、2.5mg/胚;冰片的给药剂量分别为0.3mg/胚、0.25mg/胚、0.2mg/胚、0.15mg/胚、0.12mg/胚;各药物每个剂量组接种5个鸡胚，按尿囊腔接种方法将药物接种到尿囊腔中，0.1ml/胚。空白对照组给予同体积的生理盐水，溶剂对照组给予同体积0.5％聚山梨脂-80水溶液。注射药物、封完口后把鸡胚放入37℃、饱和湿度恒温培养箱孵育96h，每日翻蛋2次，观察鸡胚的发育情况，24h内死亡的弃去，以鸡胚全部存活的最大给药剂量为药物的最大无毒剂量。
　　六、流感病毒对鸡胚半数感染量(EID50)的测定取毒种，用流水冲浸融化，用生理盐水将病毒液稀释成10-1～10-8倍，按尿囊腔接种方法接种病毒，每个稀释度接种6个鸡胚，0.1ml/胚，经37℃恒温培养箱孵育，一定的湿度培养，逐日观察鸡胚的存活情况，24h内死亡的弃去，剩下的胚孵育48h后置4℃冰箱内过夜，收获每个鸡胚的尿囊液，进行HA试验，形成“+”凝集为感染阳性，采用Reed-Muench法计算流感病毒对鸡胚的EID50。
　　七、各药物对流感病毒的防治作用预防作用即先加药，1h后再感染流感病毒，治疗作用即先感染流感，1h后再加药。实验设有空白对照组、病毒对照组、利巴韦林组、三种实验药物组。利巴韦林的给药剂量为5mg/胚;广藿香挥发油的给药剂量分别为10mg/胚、5mg/胚、2.5mg/胚;艾叶挥发油的给药剂量分别为5mg/胚、2.5mg/胚、1.25mg/胚;冰片的给药剂量分别为0.15mg/胚、0.12mg/胚、0.06mg/胚，给药体积为0.1ml/胚，每个给药剂量5个鸡胚，病毒攻击量为50 EID50。预防性给药组中空白对照组、病毒对照组给予0.1ml的0.5％聚山梨脂-80水溶液其余各药物组给予0.1ml药物，37℃孵育1h后除了空白对照组给予0.1ml的0.5％聚山梨脂-80水溶液外其余各组分别接种0.1ml流感病毒;治疗性给药组中除空白对照组给予0.1ml的0.5％聚山梨脂-80水溶液外其余各组分别接种0.1ml流感病毒，37℃孵育1h后各给药组接种0.1ml的药物，空白对照、病毒对照组给予0.1ml的0.5％聚山梨脂-80水溶液。37℃、一定湿度的孵育箱内培养，每天照检1次，每日转动1～2次，24h内死亡的弃去，孵育48h后置4℃冰箱内过夜，收获每个鸡胚的尿囊液，进行HA试验。
　　结果:
　　小鼠经H1N1感染后与正常组相比TLR2/4mRNA、MYD88mRNA、IFN-γmRNA表达水平上升(P＜0.01)，IL-4、IL-5mRNA表达水平下降(P＜0.01)。与病毒对照组相比利巴韦林组可显著增加IL-4mRNA的表达(P＜0.01)，降低IFN-γmRNA表达(P＜0.05);冰香散挥发油制剂滴鼻、雾化组能显著增加IL-4 mRNA、IL-5mRNA的表达水平(P＜0.01或P＜0.05)，但在降低IFN-γmRNA的表达上冰香散挥发油制剂滴鼻组的效果比较显著(P＜0.05)。各给药组都有降低TLR2/4、MYD88基因的表达的趋势，但只有冰香散挥发油制剂滴鼻组的作用比较显著(P＜0.01)。冰香散处方中的广藿香和艾叶在无毒且适宜的给药剂量下有防治流感病毒的作用。
　　结论:
　　冰香散挥发油制剂对鼠流感病毒有一定的防治作用，调控炎性细胞因子及模式识别受体TLR2/4及TLR2/4信号传导所依赖的MYD88基因的表达水平可能是其抗流感的重要作用机制之一，冰香散抗流感病毒的主要药效学基础物质有待于进一步的探讨。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

第一节 流感病毒概述

1．流感病毒的结构、分类及命名

2．抗流感病毒的药物研究进展

3．甲型H1N1流感病毒的诊断、传播

4．流感病毒所带来的危害与预防

第二节 冰香散的研究进展

1．冰香散的化学成分组成

2．冰香散的药理研究

第三节 鸡胚的研究进展

1．鸡胚的基本结构

2．鸡胚培养体系在病毒学中的应用

3．鸡胚培养体系在生物医学领域中的研究进展

第二章 实验研究

第一节 实验所需挥发油的制备

1．实验仪器

2．挥发油的制备

3．实验结果

4．讨论

第二节 冰香散挥发油制剂抗流感病毒免疫机制及药效学基础物质的研究

一、冰香散挥发油对鼠流感TLR2、TLR4、MYD88及Th1／Th2免疫的影响

二、广藿香挥发油、艾叶挥发油、冰片在鸡胚水平上抗流感病毒药效学研究

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢