白木香结香前后内生菌的多样性分析

摘要

目的：白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg，又称土沉香、女儿香，来源于瑞香科沉香属。白木香是我国传统中药沉香的唯一源植物，已经被列为国家二级濒危保护植物。国产沉香是白木香受物理化学的损伤或某些生物的刺激而产生的含树脂的木材，是传统名贵中药材和天然香料，具有很高的药用价值和商业价值，但其自然积累过程需要漫长的数十年，且品质不可控。沉香形成过程及其结香机制至今尚未完全研究透彻，导致实际生产中尚无高效优质的人工结香手段，同时源植物资源一直被掠夺式开发，因此市场上沉香供不应求、价格居高不下。已有不少研究证实沉香的形成与内生菌的感染有关，但其研究思路都是依托实验室培养的传统方法。本研究采用分子生物学方法，PCR-变性梯度凝胶电泳即PCR-DGGE(Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)技术，以及末端限制性片段长度多样性即T-RFLP（Terminal-restriction fragment length polymorphism， T-RFLP）技术对比白木香未结香白木及结香部位内生菌的菌落结构及多样性，探讨内生菌对白木香结香的影响，为开发更多更好的促进结香的微生物提供科学依据。
　　方法：⑴为了避免外源性微生物的污染，用已消毒的生长锥去掉取材部位的表层，取材后迅速放入已灭菌的采集袋，运输回实验室-20℃保存备用。⑵将各个样品在超净台表面消毒后无菌环境晾干。用灭菌刀片刮去样品表层组织，以防止外源性微生物DNA的污染，保证提取的核酸来自植物组织内部;同时剃除结香组样品连带的健康白木部分，保证结香组提取的微生物DNA来源于沉香。将处理好的样品无菌环境液氮研末，置于无菌离心管备用。⑶各样品总DNA提取采用植物基因组DNA提取试剂盒进行，具体操作参考按试剂盒使用说明。⑷提取的总DNA点样于1％的琼脂糖凝胶，电泳检测其片段大小，并用核酸蛋白仪测定DNA的浓度及质量。⑸以样品总DNA（稀释液）为模板，扩增引物都采用通用引物，且上游引物带上GC夹，PCR完成后，产物1.5％琼脂糖凝胶检测，合格后进行DGGE电泳，扫描凝胶得到DGGE图谱，合格后选取条带编号割胶回收，回收条带扩增产物直接送检测序。⑹以样品总DNA（稀释液）为模板，分别采用带有FAM荧光基团的细菌和真菌通用引物进行扩增。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收后胶回收试剂盒进行纯化。纯化后的PCR产物分别用限制性内切酶进行酶切。酶切产物委托上海基康生物技术有限公司进行荧光扫描。
　　结果：无论是结香组还是未结香组，DGGE都分离得到了丰富多样的真菌、细菌条带，部分结香组的内生菌多样性高于未结香组。T-RFLP扫描后获得了多个细菌、真菌菌群的T-RF片段。以往的文献报道更多的是内生真菌对结香的影响[4,5]，鲜见内生细菌的相关报道，本研究将白木香的内生细菌也作为研究对象，结果显示结香前后内生细菌菌落结构亦发生变化。
　　结论：白木香结香前后都存在大量的内生菌，相较于结香前，内生菌的数量和结构都发生了变化，以此推断，内生真菌和细菌都参与了白木香结香。

目录

声明

摘要

引言

第一章 研究背景

第一节 沉香结香研究进展

一、白木香植物学特征

二、白木香资源分布

三、沉香结香研究现状

第二节 植物内生菌的概况及研究进展

一、内生菌与植物的共生

二、白木香内生菌多样性研究

三、研究思路及意义

第二章 实验研究

2．1 实验材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 仪器与设备

2．1．3 各种实验试剂的配制

2．2 样品的前处理及DNA的提取

2．2．1 样品采集

2．2．2 样品处理

2．2．3 基因组提取及纯化

2．2．4 DNA浓度及纯度检测

2．3 DGGE技术分析白木香内生菌的菌落结构及多样性

2．3．1 实验方法

2．3．2 结果与分析

2．3．3 讨论

2．4 T-RELP分析结香前后内生菌菌落结构及多样性

2．4．1 实验方法

2．4．2 实验结果及分析

2．4．3 讨论

第三章 结语

一、主要结论

二、存在不足

三、研究展望

参考文献

附录

硕士研究生在校期间发表论文情况

致谢