血瘀和脂毒与糖脂代谢紊乱的关系及活血降糖饮的治疗作用

摘要

目的:
　　一、临床研究部分:
　　本部分研究通过比较血瘀证与非血瘀证2型糖尿病患者血清游离脂肪酸水平和游离脂肪酸谱的变化，及其与血瘀证证候积分、糖尿病大血管并发症的相关性，并分析血瘀证2型糖尿病患者血浆代谢组分及代谢途径的差异，探讨脂毒和血瘀在2型糖尿病中的可能关系及其所引起的病理生理变化，为中医药对糖脂紊乱及相关疾病的治疗提供理论依据。
　　二、实验研究部分:
　　本部分研究旨在探讨具有活血通络，益气养阴作用的活血降糖饮对脂毒性损伤所导致的大鼠胰岛素抵抗、血脂紊乱、胰岛β细胞凋亡、胰腺蛋白质组变化和大鼠胰岛素瘤细胞系（INS-1细胞系）胰岛素分泌障碍的治疗作用和可能的分子机制，从脂毒性所导致的胰岛素抵抗、胰岛β细胞凋亡、胰岛素分泌障碍等参与糖脂代谢紊乱病理生理变化的多个角度，探讨活血降糖饮对脂毒性损伤的治疗作用和可能的机制。
　　方法:
　　一、临床研究部分:
　　在2014年6月至2014年12月我院住院病人中收集血瘀证与非血瘀证且符合2型糖尿病诊断的患者各25例，观察2组患者基本情况、血瘀证证候积分及血糖、血脂等生化指标的差异，用酶联免疫(Elisa)法检测炎症因子白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-18（IL-18），用彩超检测2组患者大血管病变情况，分析与血瘀证证候积分相关的因素;并运用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术，研究2组患者血清游离脂肪酸谱的差异，分析血清游离脂肪酸与血瘀证证候积分、大血管病变的相关性。同时，运用核磁共振波谱技术（NMR）定量检测血瘀证与非血瘀证2型糖尿病患者血浆代谢物含量，通过主成分分析方法分析造成2组患者代谢组分不同的主要因素，并以此推断2组患者可能存在差异的代谢通路。
　　二、实验研究部分:
　　通过液质联用(LC-MS)技术初步检测活血降糖饮煎剂所含化学成分。采用高脂高热卡饮食喂养28周的方法建立大鼠胰岛素抵抗、高脂血症模型，将大鼠随机分为模型组、中药组、贝特组，各治疗组分别给与相应药物灌胃治疗，另设正常对照组，干预8周后，观察各组大鼠口服葡萄糖糖耐量试验(OGTT)、胰岛素释放试验(IRT)、血脂(TC、TG、LDL-c、HDL-c)、FFA、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛素敏感指数(ISI)、肝脏脂肪含量差异，肝脏组织学检查，Western blot方法检测各组大鼠肝脏及脂肪组织胰高糖素样肽-1受体（GLP-1R）和葡萄糖转运体-4（GLUT-4）蛋白表达水平。同时，观察各组大鼠胰腺脂肪含量差异，进行胰腺组织学检查，透射电镜观察胰腺超微结构，TUNEL法观察大鼠胰岛β细胞凋亡情况，分析胰腺脂肪含量和β细胞凋亡指数的相关性，Western blot方法检测各组大鼠胰腺B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）及Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平。并应用iTraq定量蛋白质组学观察各组大鼠胰腺蛋白质组的变化情况，筛选可能与凋亡和脂质代谢相关的差异表达的蛋白，用免疫组织化学方法进行初步验证。最后，用0.25mmol/L棕榈酸(PA)干预INS-1细胞48h，建立高脂诱导的胰岛素分泌缺陷模型，分为模型组、高剂量组（20％含药血清）、中剂量组（10％含药血清）和低剂量组（5％含药血清），给与相应药物干预，另设正常对照组，Elisa法检测各组INS-1细胞葡萄糖+GLP-1刺激后的胰岛素分泌情况，以及细胞内环磷酸腺苷(cAMP)浓度，Western blot方法检测葡萄糖+GLP-1刺激后各组细胞内GLP-1R、环磷酸腺苷直接激活交换蛋白（Epac-2）、蛋白激酶B(Akt)、pAkt(Ser473)蛋白表达。
　　成果:
　　一、临床研究部分:
　　（一）血瘀证2型糖尿病患者血瘀证证候积分、总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、IL-6、TNF-α、IL-18、颈动脉斑块发现率、股总动脉斑块发现率、总血管斑块发现率、颈动脉平均中-内膜厚度、颈动脉斑块面积、股总动脉斑块面积均明显高于非血瘀证患者（P＜0.05）;
　　（二）相关性分析发现患者年龄、糖尿病病程、平均中-内膜厚度、颈动脉板块面积、股总动脉板块面积与血瘀证症候积分呈正相关，其他因素与证候积分无明显相关性(P＞0.05);
　　（三）在两组患者的血清中，共检测出21种脂肪酸，造成两组患者血清游离脂肪酸谱差异的因素主要是总游离脂肪酸(TFFA)、饱和脂肪酸(SFA)、月桂酸(C12∶0)、棕榈酸(16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、花生四烯酸(C20∶4n6)、山嵛酸(22∶0)和二十四烷酸(C24∶0);
　　（四）相关性分析表明:月桂酸(C12∶0)、棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、山嵛酸(C22∶0)、TFFA、SFA与血瘀证证候积分呈正相关（P＜0.05），而其他脂肪酸与血瘀证无明显相关性（P＞0.05），多重线性回归分析只有SFA进入回归方程;
　　（五）月桂酸(C12∶0)、棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、花生四烯酸(C20∶4n6)、TFFA、SFA与颈动脉斑块面积呈正相关(P＜0.05)，亚麻酸(C18∶3n3)、顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(C20∶5n3)与颈动脉斑块面积呈负相关(P＜0.05)，棕榈酸(C16∶0)与股总动脉斑块面积呈正相关(P＜0.05)，亚麻酸(C18∶3n3)、顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六酸(C22∶6)、神经酸(C24∶1)与股总动脉斑块面积呈负相关(P＜0.05);
　　（六）通过NMR，在2组患者中，共检测出47中代谢物，2组患者代谢物组组成有重叠，但能相互区分;
　　（七）血瘀证2型糖尿病患者丙酮、乙酰乙酸、α-羟基丁酸、α-羟基异戊酸、β-羟基丁酸、α-酮基异己酸盐、3-甲基-2-氧代戊酸甲酯、3-羟基异丁酸、甘氨酸高于非血瘀证T2DM患者(P＜0.05)，而延胡索酸、柠檬酸、N-乙酰鸟氨酸、焦谷氨酸、蛋氨酸低于非血瘀证T2DM患者（P＜0.05），其他33种代谢组分在两组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　二、实验研究部分:
　　（一）对活血降糖饮煎剂成分的初步检测发现活血降糖饮煎剂含有大量黄酮类和丹参酮类物质;
　　（二）在胰岛素抵抗和肝脏及脂肪GLP-1R、GLUT-4蛋白表达方面:与正常组比较，模型组大鼠OGTT及IRT异常、体重、TC、TG、LDL-c、HOMA-IR、FFA、肝脏脂肪含量明显升高（P＜0.05），HDL-c、ISI明显下降（P＜0.05），肝脏见明显脂肪沉积，与模型组相比，中药组和贝特组OGTT及IRT改善，TC、TG、LDL-c、HOMA-IR、FFA、肝脏脂肪含量明显降低（P＜0.05），ISI明显升高（P＜0.05），肝脏脂肪含量明显减少(P＜0.05)，肝脏脂肪沉积明显改善，HDL-c改善不明显。与正常组相比，模型组大鼠肝脏GLP-1R、GLUT-4，脂肪组织GLUT-4蛋白表达下调（P＜0.01），脂肪组织GLP-1R蛋白表达上调(P＜0.01)，与模型组相比，中药组和贝特组大鼠肝脏GLP-1R、GLUT-4，脂肪组织GLUT-4蛋白表达明显上调（P＜0.05），而脂肪组织GLP-1R蛋白表达无明显差异(P＞0.05)。
　　（三）在胰岛β细胞凋亡方面:与正常组比较，模型组大鼠胰腺脂肪含量明显升高(P＜0.05)，胰腺可见明显脂肪沉积，出现凋亡早期表现，胰岛β细胞凋亡明显增加(P＜0.05)，与模型组相比，中药组和贝特组胰腺脂肪含量明显减少（P＜0.05），胰腺脂肪沉积明显改善，胰岛β细胞凋亡明显减少。相关性分析表明胰岛β细胞凋亡指数与胰腺脂肪含量呈正相关（相关系数=0.993，P=0.004）。与正常组相比，模型组大鼠胰腺Bcl-2蛋白表达明显下调（P＜0.01），Bax蛋白表达明显上调（P＜0.01），而中药组和贝特组大鼠胰腺Bcl-2蛋白表达明显上调（P＜0.01），Bax蛋白表达明显下调(P＜0.01)。
　　（四）在胰腺组织蛋白质组方面:模型组比正常组上调的蛋白有41个，下调24个，经中药治疗后上调的蛋白有28个，下调的蛋白有26个，其中18个蛋白表达差异具有一致性（在模型组中表达上调/下调和在中药组中下调/上调，称为表达差异具有一致性）其中模型组vs.正常组上调，经中药治疗后下调的蛋白共有12个，模型组vs.正常组下调，经中药治疗后上调的蛋白共有6个。经筛选及免疫组化法检测发现模型组大鼠烯酰辅酶A水合酶/3-羟氨基辅酶A脱氢酶(Ehhadh)、固醇携带蛋白（Scp-2）及脂肪酸转运蛋白1（FATP-1）表达增加，与模型组相比，中药组Ehhadh、Scp-2、FATP-1蛋白表达均减少。
　　（五）在β细胞胰岛素分泌方面:MTT法检测发现20％含药血清浓度为最佳浓度。与正常组相比，模型组细胞高糖+GLP-1刺激后，胰岛素分泌明显减少（P＜0.01），而经过不同浓度含药血清干预后，高糖+GLP-1刺激后，胰岛素分泌明显增加（P＜0.01），与高剂量组相比，低剂量组高糖+GLP-1刺激后，胰岛素分泌减少（P＜0.01）。与正常组相比，模型组细胞高糖+GLP-1刺激后，GLP-1R、Epac-2、Akt、pAkt(Ser473)蛋白表达明显下调，cAMP含量下降（P＜0.01），与模型组相比，三个浓度含药血清组cAMP含量明显升高(P＜0.01)，高剂量和中剂量组GLP-1R、Epac-2、Akt蛋白表达明显上调（P＜0.01）高剂量组pAkt(Ser473)蛋白表达上调;中剂量组pAkt(Ser473)、低剂量组GLP-1R、Epac-2、Akt、pAkt(Ser473)蛋白表达无明显差异（P＞0.05）;与高剂量组比较，低剂量组cAMP含量、GLP-1R、Epac-2、Akt、pAkt(Ser473)蛋白表达明显下调(P＜0.05)。
　　结论:
　　一、临床研究部分:
　　血瘀证与非血瘀证2型糖尿病患者血清游离脂肪酸水平、游离脂肪酸谱组成以及血浆代谢组分均存在差异。造成游离脂肪酸谱差异的主要因素是中长链饱和脂肪酸，血清游离脂肪酸谱和血瘀证症候积分以及糖尿病大血管病变存在相关关系，饱和脂肪酸是血瘀证症候积分的危险因素;同时，血瘀证2型糖尿病患者存在更严重的脂代谢紊乱，和能量代谢障碍，在氨基酸代谢途径中也存在差异。因此，脂毒和血瘀在2型糖尿病患者中存在相关关系，二者相互影响，均是2型糖尿病发生与进展中的重要病理生理变化过程。
　　二、实验研究部分:
　　活血降糖饮对脂毒性损伤的治疗作用具有多靶点，多作用机制的特点，其对脂毒性所致大鼠胰岛素抵抗、高脂血症、β细胞凋亡和胰岛素分泌障碍等多个病理生理改变均具有一定治疗作用，具体作用机制如下:
　　（一）活血降糖饮对脂毒性所导致的大鼠胰岛素抵抗和高脂血症的治疗可能与调节肝脏GLP-1R、GLUT-4和脂肪GLUT-4蛋白表达相关。
　　（二）活血降糖饮预防脂毒性所致大鼠胰岛细胞凋亡的作用可能与调节胰腺Bcl-2和Bax蛋白表达有关。
　　（三）经长时间高脂高热卡饮食喂养以及经活血降糖饮治疗后，大鼠胰腺蛋白质组发生改变，发生改变的蛋白可能主要参与脂肪酸转运和脂肪酸氧化。
　　（四）活血降糖饮含药血清对脂毒性所致INS-1细胞高糖+GLP-1刺激后的胰岛素分泌缺陷的治疗作用可能与增加GLP-1R、Epac-2、Akt、pAkt(Ser473)蛋白表达和细胞内cAMP含量有关。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 文献研究部分

第一章 脂毒性与糖尿病的研究进展

一、脂毒性在2型糖尿病发病过程中的作用及对β细胞的影响

二、脂毒性和糖尿病血管病变

三、中西医对脂毒性的防治

参考文献

第二章 活血化瘀法治疗2型糖尿病的理论及临床研究进展

一、中医理论探讨

二、现代实验及临床研究

三、糖尿病血瘀证的辨证论治

四、结语

参考文献

第二部分 临床研究部分

第一章 2型糖尿病患者血瘀证证候积分、大血管病变及游离脂肪酸谱的相关性研究

第一节 前言

第二节 研究对象及方法

第三节 结果

第四节 讨论

参考文献

第二章 血瘀证2型糖尿病患者血浆代谢组分研究

第一节 前言

第二节 研究对象及方法

第三节 结果

第四节 讨论

参考文献

第三部分 实验研究部分

第一章 活血降糖饮对高脂血症大鼠肝脏和脂肪组织GLP-1 R及GLUT-4蛋白表达的影响

第一节 前言

第二节 研究对象及方法

第三节 结果

第四节 讨论

参考文献

第二章 活血降糖饮对长期高脂喂养大鼠胰岛β细胞凋亡的影响

第一节 前言

第二节 研究对象及方法

第三节 结果

第四节 讨论

参考文献

第三章 活血降糖饮对高脂血症大鼠胰腺蛋白质组学的影响

第一节 前言

第二节 研究对象及方法

第三节 结果

第四节 讨论

参考文献

第四章 活血降糖饮对脂毒性诱导的INS-1细胞胰岛素分泌障碍的影响

第一节 前言

第二节 研究对象及方法

第三节 结果

第四节 讨论

参考文献

结语

附录

在校期间发表论文情况

致谢