基于PD-1/PD-L1信号通路研究补肾清毒法治疗CHB的作用机制

摘要

研究目的:
　　通过研究HBV感染患者PD-1/PD-L1信号通路的变化及补肾清毒法对其的影响，探讨HBV免疫耐受的作用途径以及补肾清毒法抗HBV可能的作用靶点和机制，阐明补肾清毒法治疗CHB的免疫活化机制，以及HBV持续感染免疫逃逸与中医伏气理论“肾虚邪伏肝血”病机的关系，揭示慢性乙肝伏气病机的本质，为补肾清毒法治疗CHB提供较为全面的科学依据。
　　研究方法:
　　1.将39例符合纳入标准的慢性乙型肝炎患者随机分为中西药治疗和西药治疗组。中西药治疗组20例，西药治疗组19例，纳入10例健康志愿者作为正常组。中西药治疗组服用补肾清毒方药和核苷酸类似物，西药组口服核苷酸类似物。分别在治疗前和治疗6个月后通过流式细胞检测术检测健康献血者及CHB患者外周血CTL(CD8+T)表面分子PD-1、PD-L1的表达。
　　2.通过CCK8法对肿瘤细胞(CEMX174)进行细胞毒性检测，确定补肾清毒方药的最高无毒浓度。
　　3.采集CHB患者以及健康志愿者外周静脉血20ml，分离PBMC，在6孔细胞培养板中以R10培养基培养，以rhGM-CSF，rhIL-4，rhTNF-α和IL-1β刺激诱导PBMC分化为DC，待检测成熟后，加入补肾清毒方最高无毒浓度混合培养48h。以流式细胞仪分别检测DC细胞表面分子CD80、CD86、PD-L1、PD-L2的变化。
　　4.采集CHB患者以及健康志愿者外周静脉血10ml，分离PBMC，然后以磁珠法分离CD8+T细胞和CDKT细胞，然后在24孔细胞培养板中以R20培养基培养，以PHA、IL-2培养扩增，加入补肾清毒方最高无毒浓度混合培养48h。以流式细胞仪分别检测CD8+T细胞表面分子CD28、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2的变化。
　　研究结果:
　　1.正常人及CHB患者外周血CTL(CD8+T)表面分子PD-1、PD-L1的表达
　　治疗前CHB患者外周血PBMC细胞上PD-1和PD-L1的表达百分率均比正常人高。其中治疗前慢性病毒性乙型肝炎的患者外周PBMC表面分子PD-L1在T细胞CD8+细胞及非T细胞CD8+细胞上的表达差异有统计学意义的(P＜0.05)。
　　治疗24周后，中西药治疗组及西药治疗组CHB患者CD8+T细胞上PD-1的表达水平较治疗前上调，差异有统计学意义(P＜0.01);西药治疗组的PD-1上升幅度小于中西药治疗组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　治疗24周后，中西药治疗组及西药治疗组CHB患者CD8+T细胞上PD-L1的表达水平较治疗前下调，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.CEMX174肿瘤细胞的细胞药物毒性实验CCK-8法研究结果提示:补肾清毒方药最高无毒浓度是1∶20即0.125mg/ml。
　　3.体外培养系统中树突状细胞(DC)表达共刺激分子CD80、CD86、PD-L1、PD L2的表达
　　成熟树突状细胞镜下观察结果:在倒置显微镜下能够见到胞体较前变大，胞体体表长有像毛发一样的触角，整个孕育发展的形式是以DC细胞的半悬浮形式生长的，从形态变化和生长状态角度，都符合典型树突状细胞形态学特点。
　　健康人未加药的成熟树突状细胞与CHB患者未加药的成熟树突状细胞比较，健康人成熟树突状细胞表达的共刺激分子CD80、CD86、PD-L2的表达较CHB患者高，PD L1的表达较CHB患者低，其中CD80、CD86表达差异有显著统计学意义(P＜0.01)，PD-L2表达差异有统计学意义(P＜0.05)，PD-L1表达差异无统计学意义(P＞0.05);CHB患者加药的成熟树突状细胞与健康人未加药的成熟树突状细胞比较，CHB患者成熟树突状细胞表达的共刺激分子CD80、CD86、PD-L2比健康人低，PD L1比健康人高，但是差距减少，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　健康人加药后的成熟树突状细胞与未加药的比较，加药后的成熟树突状细胞表达的共刺激分子CD80、CD86、PD-L1的表达较未加药组下调，PD-L2的表达较未加药组上调，其中CD80、CD86、PD-L2表达差异有显著统计学意义(P＜0.01)，PD-L1表达差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　CHB患者加药后的成熟树突状细胞与未加药的比较，加药后的成熟树突状细胞表达的共刺激分子CD80、CD86及PD-L2的表达均上调、PD-L1表达下调，其中CD80、CD86、PD L2表达差异有显著统计学意义(P＜0.01)，PD-L1表达差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　4.体外培养系统中CD8+T细胞表达共刺激分子CD80、CD86、PD-1、PD L1、PD-L2的表达健康人未加药的CD8+T细胞与CHB患者未加药的CD8+T细胞比较，健康人CD8+T细胞上表达的共刺激分子CD28、PD-L2的表达水平较CHB患者高，CTLA-4、PD-1、PD-L1的表达水平比CHB患者低，其中PD-L1的差异有显著统计学意义(P＜0.01)，CHB患者加药的CD8+T细胞与健康人未加药的CD8+T细胞比较，健康人CD8+T细胞上表达的共刺激分子CD28、PD-L2的表达水平仍较CHB患者高，CTLA-4、PD-1、PD-L1的表达水平仍比CHB患者低，但是差距减少，其中PD-L1表达差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　健康人加药的CD8+T细胞与未加药的比较，加药的CD8+T细胞上表达共刺激分子CD28、PD-L1、PD-L2表达下调，CTLA-4、PD1表达上调，其中CD28、PD-L2的表达差异有显著统计学意义(P＜0.01)。
　　CHB患者加药的CD8+T细胞与未加药的比较，加药的CD8+T细胞上表达共刺激分子CD28、PD-L2表达水平上调，CTLA-4、PD-1及PD-L1表达水平下调，但是差异无统计意义(P＞0.05)。
　　研究结论:
　　1.机体感染乙肝病毒(HBV)后，外周血淋巴细胞上PD-1、PD-L1表达水平高于正常人。经治疗24周后，中西药组和西药组CD8+T细胞上PD-1的表达水平上调，西药组上升幅度低于中西药组;CD8+T细胞上PD-L1的表达水平下调。表明补肾清毒方治疗CHB的作用可能通过调节PD-1/PD-L1信号通路影响免疫耐受而达到治疗CHB的目的。
　　2.体外诱导培养树突状细胞(DC)和补肾清毒汤药最高无毒浓度混合培养。补肾清毒方药使CHB患者成熟DC细胞表达共刺激分子CD80、CD86及PD-L2的表达水平上调、PD-L1表达水平下调。补肾清毒方可能是通过上调CHB患者成熟DC细胞表达共刺激分子CD80、CD86及PD-L2表达水平，抑制PD-L1表达水平达到治疗CHB的作用。
　　3.体外诱导培养CD8+T细胞同补肾清毒汤药混合培养。补肾清毒方药使CHB患者的CDK+T细胞表达共刺激分子CD28、PD-L2的表达水平上调，CTLA-4、PD-1、PD-L1的表达水平下调。补肾清毒方治疗CHB的作用可能和上调CHB患者CD8+T细胞表达共刺激分子CD28、PD-L2的表达水平，抑制CTLA-4、PD-1、PD-L1的表达水平有关。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

第一节 PD-1／PD-L1信号通路与慢性乙型肝炎

一、程序性死亡受体-1(PD-1)

二、程序性死亡配体-1(PD-L1)

三、PD-1／PD-L1与慢性乙型肝炎的关系

四、与PD-1／PD-L1信号通路相关的细胞及细胞分子

第二节 中医学对慢性乙型肝炎的认识

一、病因病机、证候分型

二、中医药对慢性乙型肝炎的治疗

三、补肾清毒法与慢性乙型肝炎的关系

第二章 实验研究

第一节 人体PBMC细胞提取及补肾清毒法对PBMC细胞中CTL细胞表面分子PD-1、PD-L1的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二节 补肾清毒法在体外培养系统中对树突状细胞表达共刺激分子(CD80、CD86、PD-L1、PD-L2)的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三节 补肾清毒法在体外培养系统中对CD8+T细胞表达共刺激分子受体(CD28、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2)的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三章 结语

参考文献

附录

在校期间论文发表情况

致谢