中药酚性抗氧化剂清除DPPH自由基机理的推断性研究

摘要

目的:
　　抗氧化剂清除自由基的机理一直存在争议，目前大部分研究主要停留在理论层面上，为了从化学实验的角度提供直接证据对理论研究成果进行验证，本课题采用GC-MS和HPLC-MS的方法分析了几种中药酚性抗氧化剂与DPPH·自由基反应的生成产物，在此基础上分析此类反应可能的机制，系统地研究此类反应的一般规律。
　　方法:
　　本课题从经典的DPPH·自由基清除反应出发，用GC-MS和HPLC-MS的方法检测分析了丁香酚、异丁香酚、香芹酚、麝香草酚、莨菪亭、芥子碱六种天然酚性中药活性成分以及BHA、BHT两种人工合成抗氧化剂清除DPPH·自由基后的产物，基于质谱结果，分析推断该反应可能的反应机制，并考察了此过程中可能出现的溶剂效应;为了探索反应条件对此类反应产物的影响，选取了BHA为代表，分别考察了BHA清除DPPH·自由基过程中，反应时间、反应温度、反应物的摩尔比等因素对反应产物类型或反应产物峰面积的影响。
　　结果:
　　GC-MS结果显示，BHA与DPPH·自由基反应的产物，分子离子峰为m/z358，其中碎片离子109与207出现差值为28的碎片丢失，指示可能生成了中间产物醌或半醌，最终生成了比较稳定的二聚体，为RAF机制;BHT与DPPH·自由基反应结果中，检测到纯净的分子离子峰为m/z430，推测为BHT与DPPH·加成产物，另一新生成的小峰显示了m/z250分子离子峰，可能发生了溶剂效应。
　　丁香酚与其同分异构体异丁香酚清除DPPH自由基的反应中，产物均检测到显著的分子离子峰m/z326，约为丁香酚或异丁香酚（m/z164）的两倍，显示了二聚体的生成，为RAF机制，但只有异丁香酚检测到另一产物分子离子峰m/z195，同理推测此过程可能伴有溶剂效应。
　　另一组同分异构体香芹酚和麝香草酚与DPPH·自由基反应，质谱图均显示纯净的分子离子峰m/z298，约为香芹酚或麝香草酚（m/z150）的两倍，且均伴随-28的碎片丢失，显示了中间产物醌或半醌的生成;以上产物的生成过程均发生了HAT或SET机制，自由基加成过程发生了RAF机制。
　　HPLC-MS检测结果中，莨菪亭与DPPH·自由基反应的二维色谱图中显示生成了一个新的产物峰(Rt=7.80min)，莨菪亭和反应产物的最大吸收波长分别是351 nm和382nm，显示了明显的红移(351nm→382nm)。HPLC-ESI-MS的分析方法结果中，产物峰显示出一个分子离子峰为m/z381.0[M-H]-，提示可能生成了莨菪亭的二聚物，此反应过程中，不仅有HAT和SET机制发生，也发生了RAF机制。
　　类似地，芥子碱硫氰酸盐与DPPH·自由基反应结果也显示多出一个反应产物峰(Rt=7.80min)，芥子碱和反应产物的最大吸收波长分别是344nm和475nm，同样出现明显的红移(344nm→475nm)。HPLC-ESI-MS结果中，产物峰显示出一个分子离子峰为m/z703.6[M-H]-，这表明产物可能为芥子碱硫氰酸盐与DPPH·自由基的加成产物，此反应过程，同样发生了HAT、SET和RAF机制。
　　BHA与DPPH·自由基反应的影响因素考察结果显示，在反应0.5hr到12hr内，随反应时间延长，产物峰面积成缓慢上升趋势;在20℃到80℃范围内，随反应温度的升高，产物峰面积反而下降;反应物摩尔比考察结果显示，BHA与DPPH·摩尔比为1∶1时产物峰面积最大。
　　结论:
　　1.八种中药酚性抗氧化剂清除DPPH自由基的反应，肯定经历了HAT（氢转移）或SET（电子转移）机制，但具体是HAT还是SET有待进一步确认;
　　2.八种中药酚性抗氧化剂清除DPPH自由基的反应，也肯定经历了RAF机制。RAF机制又分为三种类型，即二聚反应、抗氧化剂半醌式自由基与DPPH自由基的加合反应、抗氧化剂半醌式自由基与溶剂自由基的加合反应（也即溶剂效应）。具体是哪一种类型，产物需要综合考虑到空间位阻、p-π共轭、σ-p超共轭诸多因素而定。本文首次提供了上述三类RAF机制的直接证据，并提出了相关的理论分析。
　　3.影响因素考察数据显示，反应时间、反应温度和反应物摩尔比均对BHA清除DPPH·自由基反应产生影响。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献综述

1．1 自由基学说

1．1．1 衰老的自由基学说

1．1．2 自由基

1．2 抗氧化剂与疾病治疗

1．2．1 抗氧化剂概况

1．2．2 抗氧化剂在疾病治疗中的应用

1．3 抗氧化活性的体外评价方法

1．3．1 DPPH·法

1．3．2 ABTS法

1．3．3 过氧阴离子自由基(O2-·)清除法

1．3．4 HO·的清除方法

1．3．5 Fe3+离子的还原法

1．4 国内外清除自由基作用机理研究现状

1．4．1 清除自由基反应的机制

1．4．2 自由基清除反应的产物

1．5 中药酚性抗氧化剂清除DPPH·自由基研究现状

1．5．1 中药酚性抗氧化剂清除DPPH·自由基机理研究

1．5．2 以前研究存在的问题

1．5．3 本实验选取的中药酚性抗氧化剂简介

1．5．4 我们拟采用的方法及优点

第一章 实验研究

2．1 BHA与DPPH·自由基作用机理研究

2．1．1 仪器与材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 BHA与DPPH·自由基反应结果与讨论

2．1．4 BHA与DPPH·自由基反应影响因素考察

2．1．5 讨论

2．2 BHT与DPPH·自由基作用机理研究

2．2．1 仪器与材料

2．2．2 实验方法

2．2．3 BHT与DPPH·自由基反应结果与讨论

2．3 丁香酚与DPPH·自由基作用机理研究

2．3．1 仪器与材料

2．3．2 实验方法

2．3．3 丁香酚与DPPH·自由基反应结果与讨论

2．4 异丁香酚与DPPH·自由基作用机理研究

2．4．1 仪器与材料

2．4．2 实验方法

2．4．3 异丁香酚与DPPH·自由基结果与讨论

2．5 香芹酚与DPPH·自由基作用机理研究

2．5．1 仪器与材料

2．5．2 实验方法

2．5．3 香芹酚与DPPH·自由基反应结果与讨论

2．6 麝香草酚与DPPH·自由基作用机理研究

2．6．1 仪器与材料

2．6．2 实验方法

2．6．3 麝香草酚与DPPH·自由基反应结果与讨论

2．7 莨著亭与DPPH·自由基作用机理研究

2．7．1 仪器与材料

2．7．2 实验方法

2．7．3 结果与讨论

2．8 芥子碱硫氰酸盐与DPPH·自由基作用机理研究

2．8．1 仪器与材料

2．8．2 实验方法

2．8．3 结果与讨论

2．9 结论与展望

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢

附件