人蜕膜组织子宫内膜干细胞的分离、培养及生物学特性研究

摘要

研究认为，人子宫内膜功能层和基底层中存在子宫内膜干细胞(endometrial stemcells，EnSCs)，EnSCs与子宫内膜的生理性再生及子宫内膜异位症、子宫内膜息肉等疾病有明显的相关性，另外EnSCs在子宫内膜再生、盆腔脏器脱垂、膀胱尿道组织修复等已有广泛的研究。当前国内外主要从正常子宫内膜中获取EnSCs，而由于刮宫、炎症等引起的子宫内膜重度损伤患者，EnSCs的获取将成为困难。研究认为宫腔粘连的发生主要由子宫内膜基底层中EnSCs的不足或功能异常引起，所以我们尝试从蜕膜中提取EnSCs并储存，该方法具有操作方便并且不受伦理限制等优点，可为日后的相关疾病中组织修复的应用提供可靠的细胞基础。本研究从蜕膜组织中分离、纯化、扩增、培养EnSCs，并对EnSCs进行干细胞特性鉴定，通过体外诱导观察EnSCs的多向分化的潜能，为EnSCs在子宫内膜损伤、盆腔脏器脱垂、阴道重建等组织修复应用和子宫内膜异位症、子宫内膜息肉、子宫内膜癌等子宫内膜相关疾病提供可行的细胞模型。
　　目的:
　　1、研究人蜕膜组织中子宫内膜干细胞的分离及体外培养方法，并对所分离的子宫内膜干细胞的生物学特性进行初步研究。
　　2、研究人蜕膜组织中子宫内膜干细胞的生物学特性，通过体外诱导的方法研究人蜕膜组织子宫内膜干细胞向成骨细胞和平滑肌细胞的分化能力。
　　方法:
　　1、取行人工流产患者的蜕膜组织，用胰酶和胶原酶消化蜕膜组织，分离子宫内膜细胞，计数后，以极低密度接种于10 cm培养皿，分离单克隆贴壁生长的细胞，倒置显微镜观察子宫内膜干细胞形态变化及克隆形成情况。
　　2、采用CCK-8法绘制子宫内膜干细胞生长曲线，并计算倍增时间。
　　3、流式细胞仪分析子宫内膜干细胞的细胞周期及细胞表面抗原CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD146表达情况。
　　4、通过成骨诱导液和平滑肌诱导液研究子宫内膜干细胞向成骨细胞和平滑肌分化的潜能。
　　5、通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色对子宫内膜干细胞诱导分化的成骨细胞进行鉴定;免疫荧光和蛋白印迹对子宫内膜干细胞诱导分化的平滑肌细胞进行鉴定。
　　结果:
　　1、子宫内膜干细胞呈长梭形，成纤维细胞样，可见粗细不等的胞质突起，增殖至80-90％呈漩涡状生长，其克隆形成率分别为3.91％和9.14％;
　　2、EnSCs生长曲线呈“S”型，接种48 h至60 h后进入对数生长期，于第9天达到平台期，倍增时间为37-52 h。
　　3、流式细胞仪测定EnSCs细胞表面抗原CD29(99.13％)，CD44(97.39％)，CD73(99.68％)，CD90(96.76％)，CD105(89.64％)，CD146(77.96％)呈阳性表达，而CD31(1.30％)，CD34(0.68％)，CD45(1.26％)呈阴性表达，
　　4、流式细胞仪分析子宫内膜干细胞的细胞周期提示，有61.79％的细胞处于G0/G1期，22.37％的细胞处于S+G2/M期。
　　5、通过成骨诱导培养基及平滑肌诱导培养基可以成功将子宫内膜干细胞向成骨细胞和平滑肌细胞进行诱导分化。
　　结论:
　　采用组织消化法分离单克隆贴壁生长的子宫内膜细胞，能够获得纯化的子宫内膜干细胞，并能在成骨诱导培养基及平滑肌诱导培养基的诱导下，成功向成骨细胞和平滑肌细胞分化。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

1．1 子宫内膜干细胞及其相关疾病

1．2 子宫内膜干细胞的来源

1．3 子宫内膜干细胞的生物学特性

1．4 子宫内膜干细胞的应用

2．1 子宫内膜干细胞在子宫内膜修复中的应用

3．1 本论文研究的目的及意义

第二章 子宫内膜干细胞的分离培养及鉴定

一、子宫内膜干细胞的分离及培养

1 材料

2 实验方法

3 结果

二、流式细胞仪测定子宫内膜干细胞表面分子标志物

1 流式细胞仪测定子宫内膜干细胞表面标记物

2 材料

3 实验方法

三、子宫内膜干细胞细胞克隆增值能力检测

1 材料

2 实验方法

4 实验结果

四、子宫内膜干细胞细胞生长曲线及倍增时间测定

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

五、流式细胞仪测定子宫内膜千细胞细胞周期

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

六、子宫内膜千细胞细胞组织来源鉴定

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

七、讨论

八、小结

第三章 子宫内膜干细胞的分化潜能研究

一、子宫内膜干细胞向成骨细胞分化及鉴定

1 材料

2．实验方法

3 结果

二、子宫内膜干细胞向平滑肌细胞分化及鉴定

1 材料

2 实验方法

3 结果

三、讨论

四、小结

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢

综述 子宫内膜干细胞对宫腔粘连修复作用的研究进展