断藤益母汤及其组方药物对胶原诱导性关节炎大鼠骨代谢的影响及其机制研究

摘要

目的：
　　通过本研究，希望能够明确断藤益母汤对RA骨代谢影响的确切作用，重点探讨RANKL/OPG信号通路和Wnt/β-catenin信号通路在RA骨代谢中的作用机制和断藤益母汤的作用机理，为其临床应用提供理论依据。
　　方法：
　　1.断藤益母汤及其组方药物对CIA大鼠的治疗作用
　　实验分组:空白对照组(Control)、模型组(Model)、断藤益母汤组(KDM)、昆断汤组(KD)、昆母汤组(KM)、昆明山海棠组(THH)、甲氨蝶呤组(MTX)。以正常大鼠作为空白对照，以甲氨蝶呤(MTX)作为阳性对照。每组样本量为8只。
　　处理方法:应用经典的RA模型——胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型，各干预组在CIA大鼠模型加强免疫7天后即在造模第14天开始给予相应的处理。根据临床计量换算，KDM、KD、KM、THH4个中药组分别给予THH剂量4g/kg/d; MTX组参照文献给予0.9mg/kg/w; Control、Model组给予纯净水4ml/kg/d。阳性对照组每周灌胃1次，其余组每天灌胃1次，连续4周。
　　观测指标:大鼠一般情况观察，如体毛、活动、饮食、排泄等，体重变化，关节炎指数(Arthritis index，AI)评分，大鼠左、右后足爪容积;HE染色法观察大鼠左侧踝关节滑膜、软骨的病理学改变情况;ELISA法测量大鼠血清TNF-α浓度。
　　数据分析:数据采用SPSS17.0进行统计分析，以均数±标准差((x)±s)表示，采用重复测量资料的方差分析和one-way ANOVA进行统计分析，组间两两比较方差齐性时选用LSD检验，方差不齐时选用Tamhane T2法，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　2.断藤益母汤及其组方药物对CIA大鼠骨密度、骨小梁分析的影响
　　实验分组:空白对照组(Control)、模型组(Model)、断藤益母汤组(KDM)、昆断汤组(KD)、昆母汤组(KM)、昆明山海棠组(THH)、甲氨蝶呤组(MTX)。以正常大鼠作为空白对照，以甲氨蝶呤(MTX)作为阳性对照。每组样本量为4只。
　　处理方法:应用CIA大鼠模型，各干预组在加强免疫7天后即在造模第14天开始给予相应的处理。根据临床计量换算，KDM、KD、KM、THH4个中药组分别给予THH剂量4g/kg/d; MTX组参照文献给予0.9mg/kg/w; Control、Model组给予纯净水4ml/kg/d。阳性对照组每周灌胃1次，其余组每天灌胃1次，连续4周。
　　观测指标:Micro-CT影像学评价;骨骼矿物质参数指标:骨矿物质含量(bonemineral content，BMC)、骨矿物质密度（bone mineral density，BMD）;体视学测量参数指标:骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁数量(trabecularnumber，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)，骨表面积/体积(bone surfacearea/bone volume，BS/BV)、骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp);结构模型指数参数指标:骨小梁模式因子(trabecular pattern factor，Tb.Pf)、结构模型指数(structure model index, SMI)。
　　数据分析:数据采用SPSS17.0进行统计分析，以均数±标准差（(x)±s）表示，采用one-way ANOVA进行统计分析，组间两两比较方差齐性时选用LSD检验，方差不齐时选用Tamhane T2法，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　3.断藤益母汤及其组方药物对CIA大鼠破骨细胞、成骨细胞的影响
　　实验分组:空白对照组(Control)、模型组(Model)、断藤益母汤组(KDM)、昆断汤组(KD)、昆母汤组(KM)、昆明山海棠组(THH)、甲氨蝶呤组(MTX)。以正常大鼠作为空白对照，以甲氨蝶呤(MTX)作为阳性对照。每组样本量为8只。
　　处理方法:应用CIA大鼠模型，各干预组在加强免疫7天后即在造模第14天开始给予相应的处理。根据临床计量换算，KDM、KD、KM、THH4个中药组分别给予THH剂量4g/kg/d; MTX组参照文献给予0.9mg/kg/w; Control、Model组给予纯净水4ml/kg/d。阳性对照组每周灌胃1次，其余组每天灌胃1次，连续4周。
　　观测指标:抗酒石酸酸性磷酸酶及碱性磷酸酶(TRACP&ALP)双重染色法观测大鼠踝关节破骨细胞(osteoclast，OC)和成骨细胞(osteoblast，OB)的数量;ELISA法检测大鼠血清OC标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)和OB标志物骨碱性磷酸酶(BALP)的浓度。
　　数据分析:数据采用SPSS17.0进行统计分析，以均数±标准差（(x)±s）表示，采用one-way ANOVA进行统计分析，组间两两比较方差齐性时选用LSD检验，方差不齐时选用Tamhane T2法，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　4.断藤益母汤及其组方药物对PANKL/OPG信号通路的调节作用
　　实验分组:空白对照组(Control)、模型组(Model)、断藤益母汤组(KDM)、昆断汤组(KD)、昆母汤组(KM)、昆明山海棠组(THH)、甲氨蝶呤组(MTX)。以正常大鼠作为空白对照，以甲氨蝶呤(MTX)作为阳性对照。每组样本量为8只。
　　处理方法:应用CIA大鼠模型，各干预组在加强免疫7天后即在造模第14天开始给予相应的处理。根据临床计量换算，KDM、KD、KM、THH4个中药组分别给予THH剂量4g/kg/d; MTX组参照文献给予0.9mg/kg/w; Control、Model组给予纯净水4ml/kg/d。阳性对照组每周灌胃1次，其余组每天灌胃1次，连续4周。
　　观测指标:免疫组化法(IHC)观测大鼠踝关节RANKL、OPG的蛋白表达量;ELISA法检测大鼠血清RANKL、OPG的浓度。
　　数据分析:数据采用SPSS17.0进行统计分析，以均数±标准差((x)±s)表示，采用one-way ANOVA进行统计分析，组间两两比较方差齐性时选用LSD检验，方差不齐时选用Tamhane T2法，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　5.断藤益母汤及其组方药物对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用
　　实验分组:空白对照组(Control)、模型组(Model)、断藤益母汤组(KDM)、昆断汤组(KD)、昆母汤组(KM)、昆明山海棠组(THH)、甲氨蝶呤组(MTX)。以正常大鼠作为空白对照，以甲氨蝶呤(MTX)作为阳性对照。每组样本量为4只。
　　处理方法:应用CIA大鼠模型，各干预组在加强免疫7天后即在造模第14天开始给予相应的处理。根据临床计量换算，KDM、KD、KM、THH4个中药组分别给予THH剂量4g/kg/d; MTX组参照文献给予0.9mg/kg/w; Control、Model组给予纯净水4ml/kg/d。阳性对照组每周灌胃1次，其余组每天灌胃1次，连续4周。
　　观测指标:QPCR法检测大鼠踝关节Wnt3a、β-catenin、Dickkopf-1的mRNA的表达。
　　数据分析:数据采用SPSS17.0进行统计分析，以均数±标准差（(x)±s）表示，采用one-way ANOVA进行统计分析，组间两两比较方差齐性时选用LSD检验，方差不齐时选用Tamhane T2法，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结论：
　　断藤益母汤、昆断汤、昆母汤、昆明山海棠及甲氨喋呤均能不同程度改善CIA大鼠的骨侵蚀情况，其中断藤益母汤组在抑制炎症指标和促进骨保护方面均优于昆断汤、昆母汤、昆明山海棠及甲氨喋呤组;昆断汤在促进骨保护方面优于昆母汤、昆明山海棠及甲氨喋呤组;昆母汤在抑制炎症指标方面优于昆断汤、昆明山海棠及甲氨喋呤组。
　　断藤益母汤能降低CIA大鼠踝关节中RANKL的表达、升高OPG的表达，抑制RANKL/OPG信号通路对破骨细胞的分化、成熟，抑制骨吸收;同时能升高CIA大鼠踝关节中Wnt3a、β-catenin的mRNA表达、降低Dickkopf-1的mRNA表达，激活Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的分化、成熟，促进骨形成。使得失衡的破骨细胞主导的骨吸收和成骨细胞主导的骨形成恢复到相对平衡的状态。