基于PPARγ/ANGPTL4探讨白芍总苷改善阿霉素肾病的作用机理研究

摘要

目的：
　　肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)是一种常见的肾脏疾病，其主要临床特征是蛋白尿，低白蛋白血症，高脂血症和全身性的水肿。肾病综合征发生的直接原因是免疫等各种因素导致的肾小球滤过屏障的受损。足细胞及其裂孔隔膜是肾小球滤过屏障的最后一层，其在肾小球滤过功能中发挥举足轻重的作用。血管生成素样蛋白4(Angiopoietin-like Protein4)是一种新发现的分泌型蛋白，在肾病综合征中，足细胞分泌的ANGPTL4过表达可造成足细胞损伤，进而产生大量蛋白尿，影响肾病综合征的发生和发展。目前知道ANGPTL4是过氧化物增殖酶受体γ(peroxisomeproliferater-activated receptorγ，PPARγ)的靶基因。PPARγ/ANGPTL4调控作用与NS的发病机制可能具有密切相关性。白芍总苷（Total glucosides of paeony，TGP）是中药白芍干燥根的提取物，TGP具有抗炎和调节免疫的药理作用。研究表明，TGP对肾病综合征中的肾脏损害有一定的治疗作用，并可以缓解肾病中蛋白尿的发生发展。但其药理作用和机制有待进一步的阐明。因此，本实验通过一次性尾静脉注射阿霉素(adriamycin，ADR)建立NS模型，观察TGP对NS的治疗作用;在体外培养足细胞，观察白芍总苷对阿霉素刺激的足细胞的保护作用。并深入探讨TGP治疗NS的治疗作用是否与TGP对PPARγ/ANGPTL4的调控有关。
　　方法:
　　1、TGP对NS大鼠的治疗作用及对PPARγ/ANGPTL4的调控作用
　　取SD大鼠50只，10只作为空白对照，另外40只按照文献方法，一次性尾静脉注射阿霉素，建立阿霉素肾病动物模型。将造模动物分为模型组、白芍高、低剂量组、他克莫司组。自造模第二周起，药物进行灌胃治疗，连续灌胃6周。
　　①以大鼠尿蛋白，血清生化指标:血肌酐、尿素氮、总蛋白、白蛋白、甘油三酯、总胆固醇，和肾脏病理形态学评价白芍总苷对肾病综合征的治疗作用。以透射电镜观察肾组织足细胞的形态，免疫组化检测肾组织内desmin和synaptopodin的表达评价白芍总苷对阿霉素肾病综合征足细胞的保护作用。
　　②使用RT-PCR技术检测肾组织内PPARγ及ANGPTL4 mRNA的变化，使用Westeren Blot技术检测肾组织内PPARγ及ANGPTL4蛋白的表达。
　　2、TGP对足细胞损伤的保护作用及对PPARγ/ANGPTL4的调控作用
　　体外培养小鼠永生化的足细胞，将分化成熟的足细胞分为空白对照组:空白的培养基组;ADR组:0.1μmoL/L的ADR，24h; TGP组:0.1μmoL/L ADR+100μg/mL TGP，24h; GW9662组:0.1μmoL/L ADR+1μmoL/LGW9662,TGP加GW9662组:100μg/mLTGP+0.1μmoL/L ADR+1μmoL/LGW9662。
　　①以MTT检测细胞活力，AnexinⅤ/FITC试剂盒检测细胞凋亡，免疫荧光观察足细胞损伤因子desmin、正常足细胞标志分子synaptopodin的表达。
　　②以Westeren Blot检测足细胞上ANGPTL4以及PPARγ的表达，评价白芍总苷是否通过PPARγ抑制ANGPTL4的表达改善阿霉素所致的足细胞损伤。
　　结果:
　　1、TGP对NS大鼠的治疗作用及对PPARγ/ANGPTL4的调控作用
　　①与模型组比较，白芍总苷可以改善大鼠的精神状态，提高大鼠的体重，降低24h尿蛋白;降低血肌酐和尿素氮，提高血清总蛋白和白蛋白含量，降低甘油三酯和胆固醇含量，改善肾功能及降低血清脂质水平。白芍总苷还可以改善肾脏病理病变，保护足细胞的数目和功能，提高足细胞骨架蛋白synaptopodin的表达，降低足细胞损伤蛋白desmin的表达。
　　②RT-PCR及Westeren Blot结果表明，模型组的PPARγ表达降低，而ANGPTL4的表达升高。白芍总苷可以提高阿霉素肾病模型中的PPARγ的表达，减少阿霉素肾病模型中ANGPTL4的表达。
　　2、TGP对足细胞损伤的保护作用及对PPARγ/ANGPTL4的调控作用
　　①体外实验表明，TGP对培养的足细胞具有保护作用。MTT结果表明，TGP可以显著提高足细胞的活力，AnexinⅤ/FITC凋亡实验表明，TGP可以减少阿霉素引起的足细胞凋亡。并且，TGP可以明显减少阿霉素引起足细胞损伤蛋白desmin的高表达，提高足细胞骨架蛋白synaptopodin的表达。而PPARγ的抑制剂GW9662加入后可以降低足细胞的活力，促进细胞凋亡，减少synaptopodin的表达，提高desmin的表达。当PPARγ被抑制后，TGP不能提高足细胞的活力，也不能减少足细胞的凋亡，并且不能提高synaptopodin的表达，和减少desmin的表达。
　　②体外Westeren Blot实验表明，与阿霉素组比较，TGP可以提高足细胞PPARγ的表达，降低ANGPTL4的表达;阿霉素组比较，GW9662组的PPARγ的表达显著降低，ANGPTL4的表达显著升高;与GW9662比较，白芍总苷+GW9662+阿霉素组的PPARγ和ANGPTL4的表达没有差异。
　　结论:
　　1、TGP对NS模型大鼠具有良好的治疗作用，能够显著降低蛋白尿水平，提高大鼠血清蛋白水平和降低大鼠血清脂质水平，改善肾功能指标，改善NS大鼠的肾脏病理损伤，保护足细胞，从而延缓NS的进展。其机制可能是TGP可以上调PPARγ的表达，且下调ANGPTL4的表达。
　　2、TGP对体外培养的NS足细胞具有保护作用，PPARγ/ANGPTL4调节作用参与了NS足细胞损伤的过程，提示TGP可能通过上调PPARγ而抑制ANGPTL4的表达达到对NS足细胞损伤的改善作用。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

第一节 肾病综合征的现代研究

1．肾病综合征的发病机制研究

2．肾脏足细胞与肾病综合征蛋白尿的产生

3．肾病综合征动物模型的研究

第二节 白芍总苷与肾病的研究进展

1．白芍总苷对糖尿病肾病的影响

2．白芍总苷对狼疮性肾炎的影响

3．白芍总苷对肾病综合征的影响

第三节 PPARγ／ANGPTL4与肾病的研究进展

1．PPARγ／ANGPTL4概述

2．PPARγ／ANGPTL4与肾病

3．PPAPγ与ANGPTL4的关系

4．小结

第二章 实验研究

第一节 白芍总苷对阿霉素肾病大鼠的治疗作用及对PPARγ／ANGPTL4调控作用的研究

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第二节 白芍总苷对足细胞损伤的保护作用及对PPARγ／ANGPTL4的调控作用

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢