澳洲茄边碱联合二甲双胍抑制激素非依赖前列腺癌细胞生长的机制研究

摘要

目的：
　　前列腺癌是欧美国家常见的男性肿瘤，死亡率仅次于肺癌，近年来由于西化生活方式的影响，前列腺癌的发病率在亚洲国家呈现逐渐上升的趋势，且发现时大多处于晚期，内分泌治疗为患者提供了一定的生存期，但是仅能提供大约20个月的无进展生存期，后期逐渐发展为去势抵抗前列腺癌(Castration resistant prostate cancer，CRPC)，主要表现为癌细胞在缓解期后又开始增殖，PSA持续性增高，极易发生骨转移，许多患者最终死于肿瘤复发和转移。前列腺癌由激素依赖向激素非依赖的转变机制目前尚不明确，但随着研究的进展已经发现了多条与激素非依赖转变相关的信号通路，如在激素非依赖阶段血PSA持续性增高，提示了雄激素受体(Androgen receptor，AR)信号通路并未被阻断，其在去势抵抗性前列腺癌(Castration resistant prostatecancer，CRPC)发生发展中持续发挥作用。其机制主要包括雄激素受体基因的突变、扩增、AR信号通路传导异常等，以及近年来的研究热点肿瘤干细胞，这类细胞具有强大的自我更新、多向分化和高度耐药及转移潜能，被认为是肿瘤复发和转移的根源，且已有研究证明前列腺癌干细胞与PCa的耐药具有相关性。但更重要的是前列腺癌的发生发展是一个多步骤多因素的过程，涉及到细胞内的一系列复杂的变化。因此研发相对低毒高效的肿瘤靶向药物，探索能够特异性协同抑制前列腺细胞的药物组合并揭示其协同作用机制成为临床上亟待解决的问题，具有重要的理论意义和应用价值。
　　MUC1是单通道Ⅰ型跨膜蛋白，拥有重度糖基化的胞外区域，从细胞表面延伸200-500 nm,正常多分布在腺上皮或者腔管上皮细胞，如乳腺、食道、胃、十二指肠、胰腺、子宫、前列腺和肺，小部分分布在造血细胞，皮肤和间充质细胞没有MUC1的表达。在正常组织中，细胞表面MUC1带负电荷的糖链形成物理屏障并能发挥粘附和抗粘附双重作用以减轻免疫应答，且糖链可寡聚化形成黏液胶润滑基底上皮细胞，防止因PH值改变、污染物污染和微生物侵袭造成的伤害，除了正常的生理作用以外，在许多类型的癌症，如乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌、胰腺癌中，异常糖基化的MUC1常呈现过表达的趋势，因此被作为一种致瘤因子受到广泛的关注。研究表明MUC1可以调节结缔组织生长因子、血小板源性生长因子A和血小板源性生长因子B并激活MAPK和PI3K/Akt信号通路，从而促进肿瘤细胞的增殖和生存。异常的糖代谢是癌症的一个重要特征，用来维持肿瘤细胞旺盛的新陈代谢，HIF-1α可以调节糖酵解过程中关键酶的表达，MUC1作为调节器又可以调节HIF-1α的表达、稳定性和活性，并与HIF-1α形成复合物结合到糖酵解相关基因启动子上促进基因的表达和转录。此外MUC1还可以促进肿瘤细胞的侵袭和转移。侵袭作为肿瘤转移的前提和先决条件，它使细胞从基底膜分离，降解周围基质最终侵犯周围组织或进入血液。在对前列腺癌的研究中发现激素非依赖前列腺癌细胞DU145和PC3细胞相对于正常的前列腺上皮细胞PrEC MUC1表达明显增多，而激素依赖前列腺癌细胞LNCaP MUC1表达缺失，在前列腺癌细胞中MUC1-C（MUC1 C端亚基）亦能抑制AR受体的表达，使其转变为更具有侵袭力的雄激素非依赖表型并依赖MUC1-C生存，因此本课题我们将MUC1作为关键的目的蛋白进行研究，探讨前列腺癌由激素依赖向激素非依赖转变的机制及前列腺癌激素非依赖阶段的治疗。
　　我国中药资源丰富，且药理作用广泛，毒副作用小，越来越多的中药被证明其活性成分具有抗肿瘤作用，并被广泛应用于临床。因此，以MUC1为作用靶点，为前列腺癌激素非依赖阶段寻找新的抗肿瘤成分，具有一定的社会意义。
　　澳洲茄边碱(solamargine，SM)是中药龙葵主要活性成分之一，是一种天然甾体生物碱糖苷化合物和细胞毒性剂，能引起肿瘤细胞的凋亡或与其他化学药物起到协同作用，增强治疗效果，有研究表明澳洲茄边碱能增强肺癌细胞对TNFs的敏感性，课题组前期研究也表明澳洲茄边碱能通过stat3信号通路抑制肺癌细胞生长并引起肺癌细胞凋亡，但澳洲茄边碱对于去势抵抗性前列腺癌的作用未见报道。研究发现SM可以激活AMPKα，且流行病学研究表明，AMPKα的激动剂二甲双胍可以降低乳腺癌，结肠癌、胰腺癌、和肝癌症的发生风险，甚至可能改善癌症的预后。结合国内外研究，我们初步推断二甲双胍和SM可能具有一定的叠加作用。
　　本研究采用激素非依赖前列腺癌细胞株DU145和PC3为体外模型，探讨澳洲茄边碱联合二甲双胍对激素非依赖前列腺癌细胞生长的抑制作用及其可能的分子机制，并用裸鼠建立体外移植瘤模型，验证澳洲茄边碱的体内抗肿瘤活性。
　　方法：
　　1.MTT检测SM抑制DU145和PC3细胞活力的效应和时间剂量关系，流式细胞术检测SM对PC3细胞周期的影响，western-blot、RT-PCR和启动子活性检测与此有关信号通路关键蛋白的变化，并使用相关激酶抑制剂和过表达质粒以改变关键蛋白的活化状态，观察上下游信号和细胞生长抑制效应的改变。明确相关信号通路与SM引起的增殖抑制效应的关系，明确其分子机制。
　　2、设立空白对照组，剂量依次增加的SM组，作用DU145和PC3细胞，MTT和流式细胞术检测SM对细胞生长和细胞周期的影响以及是否具有时间和剂量关系，western-blot、RT-PCR等检测相关通路蛋白的表达变化，并干预其活化状态，明确SM发挥作用的信号通路。
　　3、SM联合Metformin，分为空白对照组、SM组、metformin组和SM+metformin组，MTT检测Metformin是否能增强SM抑制细胞增殖的效应，western-blot、RT-PCR等检测Metformin是否能增强SM对相关通路蛋白的影响。
　　4、建立裸鼠荷瘤模型，通过皮下注射的方法，分别设立空白对照组，SM低剂量组(5 mg/kg)和SM高剂量组(10 mg/kg)，对照组注射等量PBS，观察各组肿瘤的大小和重量差异以及有无转移瘤等，明确SM体内抗肿瘤活性。
　　结果：
　　1.SM能抑制DU145和PC3细胞生长，并能将PC3细胞阻滞在G0/G1期:6μmol/LSM作用24 h后DU145和PC3细胞活力分别下降为(49.20±4.66)％、(56.28±2.36)％并具有时间和剂量依赖（P＜0.05），10μmol/LSM作用24 h后细胞活力分别为(25.71±2.56)％、(32.07±2.53)％，（P＜0.05）。流式细胞术显示不同浓度SM(0、4、6、8μ mol/L)处理PC3细胞能引起PC3细胞阻滞在G1期，G1期细胞比例分别为(52.61±0.50)％、(52.96±1.49)％、(66.16±2.84)％和(69.03±2.38)％，后两者具与对照组比较具有统计学意义（P＜0.05）。
　　2.SM能激活AMPKα/NF-κ B/MUC1信号通路:不同浓度SM(0、1、2、4、6、8μ mol/L)处理DU145和PC3细胞，结果发现蛋白MUC1表达下调，转录因子p65亦下调，且过表达MUC1可以促进细胞的增殖，在基因水平上SM能下调MUC1mRNA的表达和启动子的活性，在对其上游信号通路的研究中发现其能激活AMPKα，且AMPKα抑制剂Compound C能逆转由SM引起的MUC1及p65下调。
　　3.二甲双胍可以增强SM的生物效应:二甲双胍联合SM相比单独SM处理组，p65、MUC1下调更明显，且AMPKα的磷酸化水平亦比单独SM处理组明显升高。
　　4.SM能抑制体内肿瘤的生长:体内实验证明SM腹腔注射能有效抑制体内肿瘤的生长，高剂量组与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果说明SM在体内具有抗肿瘤活性。
　　结论:
　　1.澳洲茄边碱可以抑制前列腺癌激素非依赖细胞DU145和PC3的生长并可引起PC3细胞周期阻滞。
　　2.澳洲茄边碱可以通过激活AMPKα抑制下游NF-κ B/MUC1信号通路，从而抑制细胞细胞生长。
　　3.澳洲茄边碱联合二甲双胍在抑制前列腺癌激素非依赖细胞生长过程中具有叠加效应。
　　4.澳洲茄边碱可以抑制裸鼠体外移植瘤的生长，作用机制与AMPKα的激活并抑制下游NF-κ B/MUC1信号通路有关。
　　综上所述我们认为澳洲茄边碱体外能够抑制DU145和PC3细胞生长，体内可以调控肿瘤生长，并证明其作用的发挥与AMPKα的激活以及下游NF-κB/MUC1信号通路有关，且二甲双胍可以增强澳洲茄边碱的药效。我们的工作进一步完善了对澳洲茄边碱生物活性的认识，为去势抵抗性前列腺癌的治疗提供了新的靶点，并为临床辅助用药提供了参考。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

1．1 去势抵抗性前列腺癌

1．2 前列腺癌激素非依赖转变机制

1．3 CRPC的治疗进展

1．3．1 多西他赛

1．3．2 阿比特龙

1．3．3 恩杂鲁胺

1．4 立项依据

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要试剂和耗材

2．1．2 细胞株

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 实验用药物

2．1．5 常用溶液的配制

2．1．6 受试化合物澳洲茄边碱的配制

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养及传代、冻存和复苏

2．2．2 MTT检测药物对细胞活力的影响

2．2．3 流式细胞术检测细胞周期

2．2．4 免疫印迹测澳洲茄边碱对PC3和DU145细胞蛋白表达的影响

2．2．5 细胞RNA的抽提和Real-Time PCR

2．2．6 质粒转化、菌落扩增及质粒提取

2．2．7 细胞转染

2．2．8 双荧光素酶报告基因检测(启动子活性)实验

2．3 数据处理与统计学分析

第三章 实验结果

3．1 澳洲茄边碱(SM)对激素非依赖前列腺癌细胞的影响

3．1．1 澳洲茄边碱对DU145和PC3生长的影响

3．1．2 SM对DU145和PC3细胞生长抑制的分子机制

3．2 澳洲茄边碱联合二甲双胍对激素非依赖前列腺癌细胞的作用

3．2．1 SM联合metformin对DU145和PC3细胞生长的影响

3．2．2 SM联合metformin对DU145和PC3细胞MUC1、p65表达的影响

3．2．3 SM联合merformin对DU145和PC3细胞AMPKα磷酸化水平的影响

3．2．4 小结

3．3 体内动物实验

3．3．1 实验材料

3．3．2 实验方法

3．3．3 实验结果

3．3．4 小结

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢