两种芋兰分枝发育相关基因LS及其调控区的克隆与表达分析

摘要

自然界中的植物形态各异，有着各自独特的株型结构。植物株型是与作物产量直接相关的生物性状，高等植物株型的形成包含着各种植株形态相关器官的发生。分枝模式是构成植物株型的关键因素，形态各样的分枝模式决定了植物株型的多样性。1968年，Donald CM提出“理想株型”的概念，是指改变植株形态以获得更为合理的结构，从而充分利用自然资源及提高产量，可以得到很大的经济效益。
　　青天葵(Herba Nervilia Plicatae)是岭南道地药材之一，常用于治疗肺系疾病，国内外需求量均较大，资源日益紧缺。其原植物为兰科芋兰属植物毛唇芋兰(Nerviliafordii(Hance) Schiltr.），该植物生长特性显著，以无性生殖为主，对环境要求苛刻，每株每年一般只长1-2个新球茎，每个球茎只长一片叶子。而青天葵的同属植物广布芋兰（Nervilia aragoana Gaud.）的一株多叶、多球茎的现象在野生苗就较常见。因此，研究这两种芋兰属植物的分枝发育功能基因，比较它们分枝发育调控机制的差异，可为通过调控功能基因促进青天葵合理分枝，提高青天葵的产量提供理论基础。
　　LATERAL SUPPRESSOR(LS)是GRAS家族参与植物分生组织发育的转录因子，是调控植物分枝的关键基因。前期课题组已分离了青天葵的NfLS基因，本研究应用同源克隆的方法分离了青天葵和广布芋兰中的LS基因组序列，通过染色体步移分离两基因的上下游调控序列，并对两基因及其调控序列进行功能分析，加深对青天葵分枝发育调控机制的了解，为得到具备多分枝或多球茎理性株型的青天葵提供依据。本论文主要研究内容和结果包括:
　　(1)采用同源克隆法获得了青天葵和广布芋兰LS的基因组DNA序列，与NfLS编码序列进行比对发现，这两个LS基因均没有内含子，且两者的核苷酸序列与氨基酸序列一致性均达99％。亚细胞定位预测显示两种芋兰的LS基因主要定位于细胞质，其次为细胞核;根据蛋白功能分类预测结果，推测NfLS、NaLS在两种芋兰中可能分别具有信号传导、胁迫应答和生长调节等功能。
　　(2)通过FPNI-PCR和SNM-PCR法获得了NfLS和NaLS的上游启动子序列和3'UTR序列各约1000 bp，比对发现两基因上、下游序列相似性分别为96％和88％，均富含A/T。利用生物信息学数据库对调控序列进行分析，显示两启动子均含有大量的TATAbox、CAAT box、GATA box、DOFCOREZM等上游元件和启动子核心元件，3'UTR区域含有polyA信号，说明LS基因的调控序列在两种芋兰中具有一定的保守性;但部分元件的类型和数量差异较大，表明种间差异性也是存在的。
　　(3)采用荧光定量PCR检测NaLS广布芋兰各组织器官在不同生长时期表达的相对表达情况，结果表明:NaLS在广布芋兰各个生长阶段的表达总量:Period2＞Period4＞Period1＞Period3，根茎、叶柄和叶片的表达趋势与总体表达趋势相似，叶片和根茎在各个阶段的表达量均较高，叶柄中的表达水平较低，球茎中的表达量伴随地上部分组织生长而降低。
　　(4)通过降落-重叠PCR及酶切连接的方法构建了两个携带芋兰属植物LS-EGFP融合基因的植物双元表达载体pR I101-LS-EGFP，转化农杆菌EHA105后，分别以浸染法转化洋葱表皮进行瞬时表达分析，初步发现NaLS-EGFP的表达定位于细胞质，而NfLS主要定位于细胞核，推测NfLS为核定位蛋白，而NaLS不是。
　　(5)以GUS为报告基因，构建NfLS和NaLS基因启动子和3'UTR的瞬时表达载体，转化农杆菌后以浸染法转化烟草叶片，NfLS、NaLS的全长启动子及其缺失片段均能启动GUS在烟草叶片表达，但活性各有差异。据GUS染色结果推测LS基因编码序列+1 bp～+72 bp区域内含有增强基因表达的元件，启动子NfLSp的核心区为-1bp～-133 bp，而-134 bp～-963 bp可能为负调控区，NaLSp也有类似的区域。NaLS3'UTR具有增强子元件，而NfLS3'UTR没有。

目录

声明

论文说明

摘要

引言

第一章 文献研究

1 植物分枝发育的研究进展

1．1 植物分枝形成的研究进展

1．2 植物分枝相关基因LS的研究进展

2 植物基因启动子的研究概况

2．1 植物启动子的结构

2．2 植物启动子的类型及特点

2．3 启动子的分离与研究方法

3 3’端非翻译区(3’UTR)与转录后调控

第二章 两种芋兰LS基因组序列的克隆及分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 基因组DNA提取

1．3 LS基因组序列的克隆

1．4 两种芋兰中LS基因的分析

2 结果与分析

2．1 LS基因组序列的扩增

2．2 T-A克隆菌液PCR检测及测序

2．3 广布芋兰NaLS基因的生物信息学分析

4 小结与讨论

第三章 两种芋兰LS基因调控区的克隆和序列分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 LS基因5’端和3’端特异性引物设计

1．3 NfLS和NaLS启动子序列的克隆及序列分析

1．4 NfLS和NaLS 3’UTR的克隆及序列分析

2 结果与分析

3 小结与讨论

第四章 NaLS时空表达分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 广布芋兰组织总RNA的提取及第一链cDNA的合成

1．3 广布芋兰NaLS和β-tubulin的qRT-PCR分析

2 结果与分析

2．1 内参及目的基因扩增效率和特异性

2．2 广布芋兰不同发育时期各器官NaLS基因的表达分析

3 小结与讨论

第五章 携带LS-EGFP融合基因植物表达载体的构建及表达分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 携带LS-EGFP融合基因植物表达载体的构建

1．3 转化农杆菌

1．4 LS-EGFP融合基因的瞬时表达

1．5 烟草的遗传转化

2 结果与分析

2．1 融合基因的构建

2．2 表达载体pRI 101-EGFP、pRI 101-NfLS／NaLS-EGFP的构建和鉴定

2．3 农杆菌的转化和鉴定

2．4 LS-EGFP融合基因的瞬时表达

2．5 农杆菌介导转化烟草

3 小结与讨论

第六章 LS启动子和3’UTR功能分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 GUS报告基因瞬时表达载体pCA1381-LSp／3’utr：：GUS的构建

1．3 农杆菌介导烟草叶片的瞬时表达

2 结果与分析

2．1 GUS瞬时表达载体构建

2．2 农杆菌的转化和鉴定

2．3 启动子和3’UTR功能初步鉴定

3 小结与讨论

第七章 结论与展望

1 结论

1．1 获得两种芋LS的基因组序列

1．2 获得NfLS、NaLS的上下游调控序列

1．3 NaLS时空表达分析

1．4 LS亚细胞定位分析

1．5 LS启动子和3’UTR活性分析

2 展望

2．1 遗传转化研究

2．2 LS基因调控模式研究

2．3 LS基因上游调控基因的研究

参考文献

附录

硕士期间发表的论文

致谢