PPARγ在铜绿假单胞菌信号分子3-0-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟中的作用

摘要

目的:
　　铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是常见医院获得性感染条件致病菌，常在机体免疫力低下，囊性纤维化，大量使用抗生素等人群中引起各种急慢性感染，且病情迁延难治[1]。
　　PA与宿主免疫细胞相互作用介导免疫逃逸是PA致病的重要方式。树突细胞(dendritic cells，DCs)是人体专职的抗原递呈细胞(Antigen presenting cells，APC)[2]，能摄取、加工及提呈抗原，刺激辅助性T细胞(T Helper cells，Th)的增殖与极化，是启动、调控、维持Th细胞免疫应答的中心环节[3]。DCs与外来抗原相互作用后，将外来抗原加工处理形成MHCⅡ-抗原肽复合物提呈给Th细胞，提供Th细胞活化的第一信号。同时，DCs表达的协同刺激分子CD40和B7(CD80、CD86)，与Th细胞表面的CD40L和CD28结合，提供Th细胞活化第二信号。另外，DCs分泌的细胞因子提供Th细胞活化第三信号，多种信号共同调节Th细胞极化。在各种病理条件下，如慢性感染，病原菌通过抑制DCs表面信号分子和细胞因子的表达而阻碍DCs成熟，使DCs逐渐被“驯化”成具有免疫抑制功能的DCs，导致Th细胞极化为抑制性T细胞（如Th2细胞和调节性T细胞），导致病情进展和反复发作[3]。因此，深入了解PA对DCs成熟的影响有助于理解Th细胞极化机制，从而揭示PA免疫逃逸的机理。
　　N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(N-3-Oxododecanoyl-L-homoserinelactone，3-O-C12-HSL)是PA群体密度感应(Quorum Sensing，QS)系统分泌的一种重要的病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)[4]，可调节细菌耐药、毒力基因的表达和宿主免疫功能。3-O-C12-HSL是一种脂溶性小分子物质，具有膜通透性，在PA致病过程中，可自由扩散直接通过细胞膜进入宿主细胞内，调节宿主功能[5]。陆续有研究表明信号分子3-O-C12-HSL可调节中性粒细胞[6]、淋巴细胞[7]和巨噬细胞[8]等多种免疫细胞的功能，影响机体的免疫防御能力。我们前期证实3-O-C12-HSL调节人单核细胞衍生树突细胞(Monocytes derived dendritic cells，Mo-DCs)的成熟与功能。我们发现:
　　第一，3-O-C12-HSL下调LPS诱导的人Mo-DCs表面分子CD40、CD80和HLA-DR表达水平，促进Mo-DCs分泌IL-10，抑制Mo-DCs分泌IL-12[9,10]。
　　第二，3-O-C12-HSL处理的Mo-DCs抑制CD4+Th细胞增殖，促进CD4+Th细胞分泌IL-4，抑制IL-12和IFN-γ的分泌，表明3-O-C12-HSL通过Mo-DCs促进CD4+T细胞向Th2方向极性分化[9]。
　　第三，3-O-C12-HSL通过Mo-DCs促进CD4+Th细胞分泌IL-10和TGF-β，3-O-C12-HSL通过Mo-DCs促进CD4+T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Tregs方向极性分化[10]。
　　前期研究结果表明3-O-C12-HSL通过阻碍Mo-DCs成熟影响CD4+T细胞极性分化，参与免疫逃逸，但3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟的相关分子机制尚不完全清楚。近期，Cooley[11]等以人支气管上皮细胞为细胞模型，发现3-O-C12-HSL干扰过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferater-activated receptorγ，PPARγ)与其配体罗格列酮(Rosiglitazone，ROS)的结合，提示3-O-C12-HSL可能与PPARγ相结合。另外，在Mo-DCs中，PPARγ与配体结合引起的生物学效应与3-O-C12-HSL对Mo-DCs的调节作用相一致[12]。为此，我们认为在Mo-DCs中，3-O-C12-HSL通过与PPARγ相结合而激活PPARγ，进而通过PPARγ下游信号通路调节信号分子表达水平，阻碍Mo-DCs成熟并调节Th细胞极化。
　　DCs的成熟状态和功能与众多基因的表达水平和细胞增殖分化密切相关[13]，而长链非编码RNA(long non-codingRNA，lncRNA)可在转录及转录后水平调控基因表达，调节细胞的增殖与分化[14]。因此，不难推测lncRNA能调控DCs的成熟与功能。为此，我们研究了3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程中lncRNA表达谱的变化情况，以lncRNAlnc-DC为候选lnc-RNA，探讨了3-O-C12-HSL对lncRNA lnc-DC表达水平的调节作用是否由PPARγ介导。
　　总之，本研究探讨了PPARγ与lncRNA在3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟中的作用。本课题的研究意义在于从PA与宿主免疫细胞相互作用的角度阐明PA免疫逃逸的相关机制，进一步丰富PA的致病机理，为PA感染的预防和治疗提供新思路。
　　方法:
　　1.配体筛选实验检测3-O-C12-HSL与PPARγ直接结合。将荧光标记的PPARγ天然配体和PPARγ混合后加入不同浓度的3-O-C12-HSL样品，检测各组的偏振光值。
　　2.检测3-O-C12-HSL对Mo-DCs中PPARγmRNA的影响。3-O-C12-HSL处理Mo-DCs，荧光定量PCR技术检测PPARγ mRNA的表达水平。
　　3.检测3-O-C12-HSL通过PPARγ对Mo-DCs成熟的影响。用PPARγ的特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs，再用3-O-C12-HSL处理Mo-DCs。流式细胞术检测Mo-DCs的吞噬能力和表面分子CD1a，CD40，CD83，HLA-DR和CD80表达水平。酶联免疫吸附实验和电化学发光法检测Mo-DCs培养上清的细胞因子IL-10、IL-12和IL-6浓度。
　　4.检测3-O-C12-HSL通过PPARγ对Mo-DCs功能的影响。用PPARγ的特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs后加入3-O-C12-HSL，处理的Mo-DCs与CSFE标记的CD4+Th细胞共培养，流式细胞术检测CD4+Th细胞的增殖，酶联免疫吸附实验检测混合培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-4表达水平。
　　5.检测3-O-C12-HSL通过PPARγ对Mo-DCs中JNK MAPK信号通路的影响。用PPARγ的特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs，再加入3-O-C12-HSL。免疫迹印实验检测JNK1/2和p-JNK1/2表达水平。
　　6.检测3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程中lncRNA表达谱的变化。用lncRNA基因芯片检测了3-O-C12-HSL处理后Mo-DCs中lncRNA，通过生物信息学技术对差异lncRNA进行聚类分析。荧光定量PCR技术鉴定候选lncRNA lnc-DC的表达水平。
　　7.检测候选lncRNA lnc-DC表达水平是否由PPARγ介导。用PPARγ的特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs后加入3-O-C12-HSL，定量PCR技术检测lnc-DC表达水平。
　　8.预测lncRNA lnc-DC启动子区域结合的转录因子，荧光定量PCR技术检测C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平是否由PPARγ介导。用PPARγ特异性拮抗剂GW9662处理Mo-DCs后加入3-O-C12-HSL，定量PCR技术检测C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平。
　　结果:
　　1.配体筛选实验显示3-O-C12-HSL大于4.60μ mol/L时竞争性结合PPARγ配体结合区。
　　2.荧光定量PCR实验发现3-O-C12-HSL下调LPS处理的Mo-DCs中PPARγ mRNA的表达。
　　3.3-O-C12-HSL下调LPS诱导的Mo-DCs表面CD40，CD83，HLA-DR和CD80表达水平。与3-O-C12-HSL实验组相比，GW9662能部分逆转CD40和CD83表达水平，CD1a、CD80和HLA-DR无统计学差异。3-O-C12-HSL抑制Mo-DCs表达IL-6和IL-12，促进Mo-DCs表达IL-10。GW9662能部分逆转3-O-C12-HSL抑制Mo-DCs表达IL-6，未能逆转3-O-C12-HSL对Mo-DCs表达IL-12和IL-10。
　　4.3-O-C12-HSL下调LPS诱导的Mo-DCs抗原吞噬能力，GW9662能部分逆转3-O-C12-HSL介导的抗原吞噬能力下调。3-O-C12-HSL处理的Mo-DCs下调CD4+Th细胞的增殖。GW9662未能恢复3-O-C12-HSL通过Mo-DCs对CD4+Th细胞的增殖的下调作用。3-O-C12-HSL处理的Mo-DCs抑制CD4+Th细胞表达IFN-γ，促进CD4+Th细胞表达IL-4。GW9662能部分逆转3-O-C12-HSL通过Mo-DCs抑制CD4+Th细胞表达IL-4。GW9662能部分恢复3-O-C12-HSL通过Mo-DCs促进CD4+Th细胞表达IFN-γ。
　　5.3-O-C12-HSL下调LPS诱导的Mo-DCs中p-JNK1/2表达水平，GW9662部分逆转3-O-C12-HSL抑制Mo-DCs中p-JNK1/2的表达水平。
　　6.与LPS模型组相比较，3-O-C12-HSL实验组筛选出2倍以上表达差异的lncRNA有1386条，其中548条表达上调，838条表达下调。表达差异5倍以上lncRNA共153条，其中22条表达上调，131条表达下调。散点图发现2倍表达差异的lncRNA总体分布呈集中趋势。聚类分析发现5倍表达差异的lncRNA能根据处理因素进行有效的分层聚类。
　　7.lncRNA基因芯片筛选实验中，3-O-C12-HSL下调LPS诱导的Mo-DCs中lnc-DC的表达水平。荧光定量PCR实验发现，LPS诱导后，lnc-DC表达水平显著上调(19.6倍)。在此基础上，添加5μ mol/L、10μmol/L和25μmol/L的3-O-C12-HSL处理后，lnc-DC的表达水平受到抑制（分别下调0.64倍、0.61倍和0.50倍）。进一步添加GW9662又能部分逆转3-O-C12-HSL对lnc-DC表达的抑制作用。
　　8.3-O-C12-HSL下调Mo-DCs中C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平，其作用方式依赖于PPARγ，提示3-O-C12-HSL可能通过C-Fos和C-Jun调节lnc-DC表达水平。
　　结论:
　　1.3-O-C12-HSL直接与PPARγ相结合，下调PPARγ mRNA表达水平。
　　2.3-O-C12-HSL通过PPARγ部分调节Mo-DCs的成熟与功能。
　　3.3-O-C12-HSL作用于Mo-DCs后，lncRNA表达谱发生特征性变化。
　　4.3-O-C12-HSL下调lncRNA lnc-DC表达，其作用方式依赖于PPARγ。
　　5.3-O-C12-HSL下调C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平，其作用方式依赖于PPAR-γ。

目录

声明

摘要

引言

第一章 3-O-C12-HSL通过PPARγ调节Mo-DCs成熟与功能

1．1 材料

1．1．1 细胞

1．1．2 耗材

1．1．3 主要试剂

1．1．4 主要仪器

1．1．5 各种实验试剂的配制

1．2 方法

1．2．1 配体筛选实验

1．2．2 Mo-DCs的分离与培养

1．2．4 mRNA定量检测

1．2．5 抗原吞噬实验

1．2．8 CD4+Th细胞分离与培养

1．2．9 混合淋巴细胞实验

1．2．10 蛋白免疫印迹实验

1．2．11 数据分析

1．3 结果

1．3．1 3-O-C12-HSL与PPARγ结合

1．3．2 Mo-DCs的培养

1．3．3 3-O-C12-HSL影响Mo-DCs活力

1．3．5 3-O-C12-HSL通过PPARγ调节Mo-DCs吞噬功能

1．3．6 3-O-C12-HSL通过PPARγ调节Mo-DCs表面分子表达水平

1．3．7 3-O-C12-HSL通过PPARγ调节Mo-DCs细胞因子的分泌

1．3．8 3-O-C12-HSL处理的Mo-DCs调节CD4+Th细胞增殖

1．3．9 3-O-C12-HSL处理的Mo-DCs调节CD4+Th细胞分泌细胞因子

1．3．10 3-O-C12-HSL通过PPAR Y调节JNK MAPK信号通路

1．4 讨论

第二章 3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程中lncRNA表达谱的变化

1．1 材料

1．1．1 细胞

1．1．5 各种实验试剂的配制

1．2 方法

1．2．1 Mo-DCs的诱导与培养

1．2．4 图像采集和数据分析

1．2．5 lncRNA lnc-DC的生物信息学预测

1．2．6 lncRNA和mRNA的定量检测

1．3 结果

1．3．1 样品总RNA的质量鉴定

1．3．2 芯片杂交结果

1．3．3 表达差异lncRNA的散点图分析

1．3．4 表达差异lncRNA的聚类分析

1．3．5 3-O-C12-HSL下调lncRNA lnc-DC表达水平

1．3．6 lncRNA lnc-DC的生物信息学分析

1．3．7 3-O-C12-HSL下调C-Fos和C-Jun的mRNA表达水平

1．4 讨论

结语

参考文献

文献综述

附录

在校期间发表论文情况

致谢