加味茵陈四逆汤预防给药对肝纤维化幼鼠TGF-β1/Smads通路的影响

摘要

肝纤维化是一个可逆的创伤修复反应，也是所有慢性肝脏损伤的必经通路。随着疾病负担日益下降，年轻患者中出现门静脉高压的后遗症、肝衰竭和肝硬化相关肝细胞癌的越来越多。全球疾病负担预测肝硬化和肝细胞癌占到全球所有死亡人数的2.5％，肝移植是唯一有效治疗失代偿性肝病的方法;然而，北美和欧洲已出现供体器官短缺的情况，这一现象导致等待肝脏移植患者的死亡率增加约20％。不仅仅成人会出现肝纤维化，婴幼儿也很常见。胆道闭锁在活产婴儿中发病约1/5000～1/19000，而亚洲国家发病率比欧洲国家更高。胆道闭锁肝纤维化是一种普遍和突出的疾病特点，其肝纤维化进展速度明显超过其他肝胆疾病，90天以上的患儿已不宜行肝门肠吻合术（Kasai术），需要行肝移植才能长期生存;婴儿肝炎综合征是一组婴儿期（包括新生儿期）起病的临床症候群，以黄疸、肝脏病理体征（肝肿大、质地异常）和肝功能损伤为特征。由于致病因素的持续作用和机体免疫功能失调，肝细胞直接受损或免疫损伤，纤维组织不断增生，肝脏组织渐渐由炎症受损阶段过渡到肝纤维化阶段，以胶原蛋白、蛋白多糖及粘连蛋白等多种细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肝内过度沉积为其主要病理变化。目前肝纤维化研究较多且较为关键的信号通路即为TGF-β1/Smads信号通路，药物阻断或干预TGF-β1/Smads信号通路能有效影响或遏制肝纤维化的发生、发展。现药物大多数针对成人肝纤维治疗，小儿用药少之又少，以及早且有效干预、毒副作用小为目标，人们将研究目光转投中医药，希冀从中医药当中探寻到防治肝纤维化的有效药物。
　　本课题组在前期临床研究已表明加味茵陈四逆汤对小儿胆道闭锁Kasai术后治疗可改善临床症状、延缓术后肝纤维化的发生、提高患儿的生存质量;细胞实验证明了加味茵陈四逆汤对肝星状细胞的TGF-β1/Smads信号通路方面有一定作用，但加味茵陈四逆汤的药物疗效和作用机理尚留有空白。同时，本研究也是国家自然科学基金项目“加味茵陈四逆汤对胆道闭锁小鼠肝纤维化模型TGF-β1/Smads通道及MMPs/TIMPs的影响研究（课题编号:81373686）”的部分内容。
　　目的:
　　观察加味茵陈四逆汤对四氯化碳诱导肝纤维化幼鼠模型的预防干预作用，研究其对脏器指数、肝脏病理组织学及血清学指标的影响，并从TGF-β1/Smads信号通路方面探索其可能的作用机制。
　　方法:
　　将42只Wistar雄性幼鼠随机分为空白组、溶剂对照组、模型组、秋水仙碱组、加味茵陈四逆汤高剂量组、加味茵陈四逆汤中剂量组、加味茵陈四逆汤低剂量组，每组6只。除空白组、溶剂对照组外，其余各组幼鼠均腹腔注射0.15ml/kg50％CCl4，溶剂对照组幼鼠腹腔注射0.15ml/kg橄榄油，均为每周2次，连续21天。溶剂对照组和模型组每日给予灭菌水10ml/kg灌胃，秋水仙碱组每日给予秋水仙碱0.1mg/kg灌胃;加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组每日分别予加味茵陈四逆汤16.46g/kg、8.23g/kg、4.12g/kg灌胃;空白组不做任何处理，每日1次给药，给药周期21天。于实验第22天进行腹主动脉取血和提取肝脏、脾脏样本。将提取肝脏和脾脏于电子天平称重，测定肝、脾指数;通过HE染色观察肝脏情况，采用Ishak评分系统了解肝纤维化程度;以赖式微板法检测血清ALT、AST水平;通过竞争性抑制酶联免疫吸附测定血清HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ含量;采用RT-qPCR检测TβRI mRNA、Smad3mRNA、Smad7 mRNA、CollagenⅠ mRNA、CollagenⅢ mRNA的表达;采用Western Blot检测TβRI、Smad3、Smad7、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白的表达。
　　结果:
　　1.加味茵陈四逆汤对肝指数和脾指数的影响
　　与空白组相比，模型组肝指数、脾指数明显升高（P＜0.05），溶剂对照组肝指数、脾指数无明显差异（P＞0.05）;与模型组相比，秋水仙碱组、加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组肝指数、脾指数明显降低（P＜0.05）。
　　2.加味茵陈四逆汤对肝组织的影响
　　(1)空白组和溶剂对照组幼鼠肝小叶结构完整，轮廓清晰，汇管区及其周围未见小胆管及纤维组织增生。模型组肝小叶结构被破坏，甚至消失，肝索排列紊乱，汇管区大量增生的纤维，呈条索状，从汇管区伸向相邻的汇管区形成纤维桥连并分割肝实质，肝间质有大量炎细胞浸润。秋水仙碱组和加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组存在肝小叶结构不清晰，肝细胞可见肿胀和明显脂肪变性，肝间质有炎细胞浸润，而且汇管区都有不同程度的肝纤维化表现，但纤维化程度均较模型组有明显的减轻。
　　(2)空白组和溶剂对照组没有纤维化发生（P＞0.05）;模型组与空白组比较病理评分显著升高（P＜0.05）;秋水仙碱组和加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组与模型组比较病理评分明显降低（P＜0.05）。
　　3.加味茵陈四逆汤对血清ALT、AST的影响
　　与空白组相比，模型组ALT、AST显著性升高（P＜0.05），溶剂对照组ALT、AST无明显差异(P＞0.05);与模型组相比，秋水仙碱组、加味茵陈四逆汤高、中、低剂量组ALT明显降低(P＜0.05)，而各用药组AST无显著性差异（P＞0.05）。
　　4.加味茵陈四逆汤对血清HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ的影响
　　与空白组相比，模型组HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ显著升高（P＜0.05），溶剂对照组各指标无明显差异（P＞0.05）;与模型组相比，除加味茵陈四逆汤低剂量组HA、LN无显著性差异（P＞0.05）外，各用药组HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ明显降低（P＜0.05）。
　　5.加味加味茵陈四逆汤对Tβ RI mRNA、Smad3 mRNA、Smad7mRNA、CollagenⅠ mRNA、CollagenⅢ mRNA表达的影响
　　(1)与空白组相比，模型组Tβ RI mRNA相对表达量明显升高（P＜0.05），溶剂对照组无明显差异（P＞0.05）;与模型组相比，秋水仙碱组和加味茵陈四逆汤高、中剂量组Tβ RI mRNA相对表达量明显降低（P＜0.05），加味茵陈四逆汤低剂量组无明显差异(P＞0.05)。
　　(2)与空白组相比，模型组Smad3 mRNA相对表达量明显升高(P＜0.05)，溶剂对照组无明显差异(P＞0.05);与模型组相比，秋水仙碱组和加味茵陈四逆汤中剂量组Smad3 mRNA相对表达量明显降低（P＜0.05），加味茵陈四逆汤高、低剂量组无明显差异(P＞0.05)。
　　(3)与空白组相比，模型组和溶剂对照组Smad7 mRNA相对表达量无显著性差异（P＞0.05）;与模型组相比，加味茵陈四逆汤中剂量组Smad7 mRNA相对表达量明显降低(P＜0.05)，秋水仙碱组和加味茵陈四逆汤高、低剂量组无明显差异（P＞0.05）。
　　(4)与空白组相比，模型组CollagenⅠ mRNA相对表达量明显升高(P＜0.05)，溶剂对照组无明显差异（P＞0.05）;与模型组相比，加味茵陈四逆汤中剂量组CollagenⅠ mRNA相对表达量显著降低(P＜0.05)，秋水仙碱组和加味茵陈四逆汤高、低剂量组无明显差异(P＞0.05)。
　　(5)与空白组相比，模型组CollagenⅢ mRNA相对表达量明显升高（P＜0.05），溶剂对照组无明显差异（P＞0.05）;与模型组相比，秋水仙碱组、加味茵陈四逆汤高、中剂量组CollagenⅢ mRNA相对表达量显著降低(P＜0.05)，加味茵陈四逆汤低剂量组无明显差异(P＞0.05)。
　　6.加味茵陈四逆汤对TβRI、Smad3、Smad7、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达的影响
　　(1)与空白组相比，模型组TβRI蛋白相对表达量升高（P＜0.05），溶剂对照组无明显差异（P＞0.05）;与模型组相比，各用药组TβRI蛋白相对表达量无显著性差异(P＞0.05)。
　　(2)与空白组相比，模型组Smad3蛋白相对表达量显著升高(P＜0.05)，溶剂对照组无明显差异（P＞0.05）;与模型组相比，加味茵陈四逆汤中、低剂量组Smad3蛋白相对表达量明显降低（P＜0.05）。
　　(3)与空白组相比，模型组Smad7蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05），溶剂对照组无明显差异（P＞0.05）:与模型组相比，各用药组Smad7蛋白相对表达量无显著性差异(P＞0.05)。
　　(4)与空白组相比，模型组CollagenⅠ蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05），溶剂对照组无明显差异（P＞0.05）;与模型组相比，各用药组CollagenⅠ蛋白相对表达量无显著性差异（P＞0.05）。
　　(5)与空白组相比，模型组CollagenⅢ蛋白相对表达量显著升高（P＜0.05），溶剂对照组无明显差异(P＞0.05);与模型组相比，加味茵陈四逆汤中剂量组CollagenⅢ蛋白相对表达量明显降低(P＜0.05)。
　　结论:
　　加味茵陈四逆汤高、中、低三个剂量对CCl4诱导的肝纤维化幼鼠预防给药能不同程度上减轻幼鼠肝脏炎症和纤维化程度以及脾脏症状。加味茵陈四逆汤可降低ALT、HA、LN、IV-C、PCOL-Ⅲ，同时HA、LN的变化与药物浓度存在相关性。提示加味茵陈四逆汤对幼鼠肝纤维化有一定的预防作用。加味茵陈四逆汤通过抑制TGF-β1/Smads信号通路的Tβ RI、Smad3的表达以致CollagenⅠ和CollagenⅢ的表达下调，从而发挥抗纤维化作用，其抑制这二者的程度与药物浓度不一定成正比。加味茵陈四逆汤组Smad7蛋白表达与模型组比较虽无明显差异，但有升高趋势，这与Smad7mRNA表达趋势相异，推测可能有其他信号通路参与或因素影响蛋白转录水平。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

第一节 肝纤维化的研究进展

一、肝纤维化与细胞

二、肝纤维化与信号通路

第二节 中医药治疗肝纤维化的研究进展

一、单味中药

二、中药提取物

三、复方药物

四、中成药

五、外治法

六、本课题团队研究进展

第二章 实验研究

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．4 讨论

实验二 加味茵陈四逆汤对肝纤维化幼鼠肝功能AST、ALT和肝纤维化因子HA、LN、COL-Ⅳ、PCOL-Ⅲ的影响

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．4 讨论

实验三 加味茵陈四逆汤对肝纤维化幼鼠TGF-β1／Smads通路中TGF-β Recptor1、Smad3、Smad7、CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA表达的影响

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．4 讨论

实验四 加味茵陈四逆汤对肝纤维化幼鼠TGF-β1／Smads通路中TGF-β Recptor1、Smad3、Smad7、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达的影响

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．4 讨论

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢