济生肾气丸治疗肾气不足型肾结石的临床疗效与机制研究

摘要

背景：
　　肾结石是我国也是世界最常见的泌尿外科疾病之一，世界范围内的发病率为1％～20％。在我国，一般人群中发病率达1％～10％，其中25％的患者需住院治疗。改革开放后，随着生活水平的提高，肾结石的发病率在我国大幅度增长，业已成为世界上三大结石高发地区之一[4]，在我国南方诸省中，以肾结石为主的肾结石患者几乎均占泌尿外科住院患者的首位。这种不良的增长趋势不得不引起我们泌尿外科医生的重视。
　　肾结石治疗后存在结石残留和远期高复发率(15至20年内复发率60％-80％)的特点，所以，“清除残留结石和防石”对肾结石的防治、预后意义重大。笔者在临床工作中发现，因肾结石住院治疗的老年患者（年纪≥55岁）大多数具备肾气不足症状，辨证论治予以济生肾气丸治疗后疗效明显改善，结石也有减少，该中药得到了许多患者的认可。欣喜之余，我们设想，济生肾气丸是否可以解决上述的难题（排石、防石）呢，我们查阅文献，未发现有过肾气不足肾结石的相关“防、治”研究。由于中医治疗“淋证”先以清热通淋排石等治标为先，后以补肾固本善后。中医理论认为，排石乃属“治标”，石净后，当图根本，否则肾气仍虚，机体仍然处于不平衡状态，日后复有重新结石之虞，此观点在老年肾结石患者尤为适用。现代医学中肾结石术后结石复发率很高，术后结石虽除，但对肾气是否充足应进一步辨治，如若忽略此项，对于肾气不足型肾结石的治疗与预后是非常不利的。
　　目的：
　　所以，本着“治病救人，发扬中医”的职责，笔者认为有必要通过临床和实验研究两方面验证济生肾气丸治疗肾气不足型肾结石的临床疗效（排石、防石、改善症状）、安全性、不良反应，及其作用机制。以期进一步探索经方防治肾结石的特色疗效及安全性与可能的作用机制。
　　方法：
　　1、临床研究:
　　通过2015年6月至2017年2月这段时间内，在广中医第一附属医院，因肾结石而在外科行PCNL术后的住院患者，年纪≥55岁，中医辨证归属于“肾气不足”型，符合诊断、纳入标准的患者纳入本研究，共65人（男39人，女26人，平均年龄60岁）。按随机原则分为治疗组（济生肾气丸组34例）及对照组（枸橼酸钾颗粒组31例）。治疗组与对照组均从PCNL术后第7天开始服用指定药物，疗程7个月。两组病人分别于用药前及服药后1个月、第4个月、第7个月（即每隔3个月）各记录一次相关体征、症状和疗效性指标、肝功能和副作用等并详细记录。数据经收集整理后进行统计学处理分析。
　　2、实验研究:
　　(1)大鼠情况:SPF级雄性SD大鼠62只，体重240g±20g。
　　(2)肾气不足证候大鼠的建立:
　　①在容积为20L的大塑料水桶内注入30度的温水至40cm深，每桶放入5只大鼠。强迫雄性大鼠每日游泳3-5次，每一次至大鼠精疲力尽即将下沉时捞起，捞上来让大鼠休息15-20分钟再次放入水桶中。连续2周。以诱导劳倦过度所致的“气虚”模型。分析:劳倦伤脾，过度劳倦伤气。
　　②录制猫叫声，每日不定时播放给大鼠，每次1-1.5小时，音量＞60分贝，每日至少3次。连续2周。此法为利用大鼠所害怕的声源进行刺激，造成“恐伤肾”模型。
　　③两种方法合用，连续2周，造成大鼠“肾气不足”证候模型。
　　(3)肾气不足型肾结石（草酸钙肾结石）大鼠的建立、分组级给药:
　　在“肾气不足”证候大鼠模型的基础上，将SPF级雄性SD大鼠62只随机分为6组，分别是:正常组10只，模型组11只，中药低剂量组10只，中药中等剂量组10只，中药高剂量组11只，阳性对照药物（枸橼酸钾颗粒）组10只。7天适应性喂养进行，第8天起造模。
　　空白组:常规喂养（共21天）;
　　模型组:1％乙二醇自由饮水+2％氯化铵灌胃(ig)2.6ml/只/天+10％葡萄糖酸钙腹腔注射1.95ml/只/天（共21天）→（注:以下称:肾结石造模方法）;
　　中药低剂量组:肾结石造模方法+低剂量中药灌胃(ig)（共21天）;
　　中药中等剂量组:肾结石造模方法+中等剂量中药灌胃(ig)（共21天）;
　　中药高剂量组:肾结石造模方法+高剂量中药灌胃(ig)（共21天）;
　　阳性药物对照组:肾结石造模方法+阳性药物（枸橼酸钾颗粒）灌胃(ig)（共21天）。
　　(4)大鼠取材及观测指标:
　　经过21天草酸钙肾结石造模及给药后取6组大鼠，称重并记录。腹主动脉抽血并离心取血清;切取右肾并予甲醛溶液中固定;切取左肾，新鲜备用。
　　测血清SOD活力、MDA含量、血肌酐Cr、血尿素氮BUN、血清Ca2+离子的含量。
　　右肾做HE染色制成病理切片;显微镜下观察肾脏病理变化及草酸钙结晶的附着沉积情况，结晶分布与数量情况分别用“0级、Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级”进行分级。
　　取1/4左肾，匀浆制备，轻胺法测SOD活力，硫代巴比妥酸法MDA含量。
　　取1/4左肾，运用Western-blotting检测技术测大鼠肾脏组织中IKB、IKK、NF-KB、P65的表达情况;运用ELISA酶联免疫检测法测大鼠肾脏组织中1L-1β的表达。
　　结果：
　　1、临床结果:
　　治疗前，两组纳入病例在性别、年龄、PCNL术后残余结石数量、结石直径、血清肌酐Cr、尿素氮BUN、肝功能ALT、AST、TBIL、肾气不足中医证候总分、腰腹疼痛、尿中带血、小便不利、腰膝酸软无力、倦怠乏力、畏寒肢冷、颜面或肢体水肿、痰饮咳喘等中西医各项指标基线相同(p＞0.05)。两组在治疗后第1个月、第4个月、第7月观察时，治疗组除了在结石直径上与对照组无统计差异(p＞0.05)，其他指标如:残余结石数量、血清肌酐Cr、尿素氮BUN、肾气不足中医证候总分、腰腹疼痛、尿中带血、小便不利、腰膝酸软无力、倦怠乏力、畏寒肢冷、颜面或肢体水肿、痰饮咳喘等的疗效均明显优于对照组，统计学有差异(p＜0.05);在治疗过程中，治疗组不良反应明显少于对照组(p＜0.05);7个月的药费，治疗组花费不到西药组费用的3/10，可节约成本7/10以上(p＜0.05)。
　　2、动物实验结果:
　　2.1从各组大鼠肾脏病理切片中，草酸钙结晶沉积程度与肾组织病理改变情况的比较来讨论:
　　模型组与空白组比较，有明显结晶沉积(P＜0.05)，镜下见:大量不规则形态的结晶，肾小管扩张明显，肾小球呈不规则形态，周围炎性细胞浸润明显，皮质肾髓质排列紊乱。说明了该造模方法是成功的，且成石率较高。
　　济生肾气丸3个剂量组结晶沉积度与病理情况与模型组、空白组、西药组比较均有不同。中药中等剂量组、高剂量组比模型组结晶减少(P＜0.05)，且高剂量组统计有显著性差异(P＜0.01)，说明高、中剂量中药均能抑制肾结石的形成，且高剂量疗效显著。
　　低剂量组与模型组相比较(P＞0.05)，抑制肾结石的形成无明显疗效。
　　西药组与模型组相比较(P＜0.05)，能抑制肾结石的形成。
　　中药高剂量组与西药组抑制肾结石形成的疗效相似(P＞0.05)。
　　2.2从各组大鼠血清SOD活力、MDA含量、肾组织SOD活力、MDA含量、血肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)、血清Ca2+离子的含量来比较讨论:
　　肾组织总SOD活力与血清SOD活力的变化趋势与肾组织总MDA含量与血清MDA含量水平的变化趋势是一致的。说明局部与整体的关系是一致的，共同提示清除氧自由基的能力，提示机体抗氧化能力与氧化损伤程度。
　　模型组与空白组比较:肾组织SOD活力、血清SOD活力有降低(P＜0.05)，肾组织MDA含量、血清MDA含量升高(P＜0.05)，血Cr与血BUN均有升高趋势(P＜0.05)，说明模型组抗氧化损伤能力下降、肾组织细胞氧化损伤加重，肾功能受损严重。
　　低剂量组与模型组比较:肾组织总SOD活力、血清SOD活力、肾MDA含量、血清MDA含量、血肌酐Cr与血尿素氮BUN、血钙Ca2+均无明显改善(P＞0.05)，说明中药低剂量组在提升大鼠肾脏组织细胞抗氧化损伤能力、保护肾功能、降低肾结石形成危险因素中血钙等方面，疗效不明显。
　　中等剂量组与模型组比较:肾组织总SOD活力、血清SOD活力、肾MDA含量、血清MDA含量、血肌酐Cr与血尿素氮BUN、血钙Ca2+有改善(P＜0.05)，说明中等剂量组在提升大鼠肾组织细胞抗氧化损伤能力、保护肾功能方面有一定的疗效，但在降低肾结石形成危险因素中血Ca2+这一方面无明显疗效。
　　高剂量组与模型组比较:肾组织总SOD活力、血清SOD活力、肾MDA含量、血清MDA含量、血肌酐Cr与血尿素氮BUN均有明显改善趋势(P＜0.01)，说明高等剂量组在提升肾脏组织细胞抗氧化损伤能力、保护肾功能方面有显著的疗效;在降低血Ca2+这一方面疗效不明显。
　　西药组与模型组比较:肾组织总SOD活力、血清SOD活力、肾总MDA含量、血清MDA含量、血钙Ca2+方面均有改善(＜0.05)，说明西药组在在提升肾组织细胞抗氧化损伤能力、降低血Ca2+方面有明显的疗效;但血Cr与血BUN均无明显差异(P=0.081＞0.05)，说明西药组在保护肾功能方面的无明显疗效。
　　中等剂量组与西药组比较:在提高肾脏组织细胞抗氧化损伤能力方面无明显差异(P＞0.05)，在保护肾功能方面的疗效优于西药组(P＜0.05);两组在降低血钙方面疗效无统计差异(P＞0.05)。
　　高剂量组与西药组比较:在提高肾脏组织细胞抗氧化损伤能力方面有明显的疗效(P＜0.05)，在保护肾功能方面的疗效优于西药组(P＜0.01);两组在降低血钙方面疗效无统计差异(P＞0.05)。
　　2.3从各组大鼠肾组织中的IKB、IKK、NF-KB、P65的Western-blotting检测表达情况，和肾脏组织中1L-1β的ELISA检测的表达情况讨论:
　　模型组与空白组比较:NF-KB通路中的因子IKB表达有下调，IKK和NF-KB/P65表达有上调，炎性因子1L-1β的表达有上调，统计均有意义(P＜0.05)，说明造模方法是成功的，已经造成了肾组织的炎性损伤，发生了炎症反应。
　　与模型组比较，中药中等剂量组、高剂量组均能使NF-KB通路中的因子IKB表达有上调，IKK和NF-KB/P65表达有下调，炎性因子1L-1β的表达有下调，统计均有差异(P＜0.05)，反应中等剂量组对于抑制肾脏炎症损伤有一定的疗效，而高剂量组疗效更显著(P＜0.01)。
　　与模型组比较，中药低剂量组因子IKB、IKK和NF-KB/P65、1L-1β表达无统计学差异(P＞0.05)，说明低剂量组对于抑制肾脏炎症损伤无明显疗效。
　　西药组与模型组相比较:以上因子有改变(P＜0.05)，反应西药组抑制肾脏炎症损伤有一定疗效。
　　与西药组相比较:中药高剂量组NF-KB通路中的因子IKB表达、IKK和NF-KB/P65表达有所改善，炎性因子1L-1β的表达较为相近(P＜0.05)，说明高剂量组抑制肾脏炎症损伤的疗效优于西药组。
　　结论：
　　1、临床结论
　　济生肾气丸治疗肾气不足型肾结石患者，可明显减少残余结石数量，保护肾功能(Cr↓、BUN↓)，同时对肾气不足中医证候总分、腰腹疼痛、尿中带血、小便不利、腰膝酸软无力、倦怠乏力、畏寒肢冷、颜面或肢体水肿、痰饮咳喘等症状有明显改善。在为期7个月的疗程中，不良反应发生率较低;未出现毒副作用。且经济费用不到西药组的3/10。
　　2、实验结论
　　济生肾气丸有抗氧化损伤(SOD↑、MDA↓)、抗炎性反应(IKB↑、IKK↓、NF-KB↓、P65↓、1L-1β↓)、保护肾功能（Cr↓、BUN↓，肾病理切片结晶沉积↓、肾组织破坏↓）的作用，且有防石作用。
　　济生肾气丸可能通过抗氧化损伤(OS)与抗炎症反应（NF-KB通路）来保护肾小管上皮细胞与肾功能的。
　　所以，济生肾气丸治疗肾气不足型肾结石具有一定的可行性及优越性，值得临床进一步研究与应用。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

1．1 现代医学对肾结石的认识

1．1．1 流行病学

1．1．2 预后

1．1．3 病因与发病机制及相关学说

1．1．4 肾结石危险因素

1．1．5 临床诊断

1．1．6 肾结石的西医治疗

1．2．2 肾小管上皮细胞氧化损伤促进草酸钙肾结石形成机制

1．2．3 肾小管上皮细胞氧化损伤与草酸钙肾结石相互影响的恶性循环机制

1．2．4 草酸和草酸钙晶诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤(OS)与炎症反应(NF-κB通路)在草酸钙肾结石形成中的作用

1．3 肾结石的中医学认识

1．3．1 中医古籍对肾结石的认识渊源

1．3．2 肾结石的中医病因病机

1．3．3 中医对肾结石的辨证论治

1．3．4 济生肾气丸对肾结石的治疗作用

第二章 临床研究

2．1 研究目的

2．2 研究对象

2．3 西医诊断标准

2．3．1 影像学检查

2．3．2 症状体征

2．3．3 实验室检查

2．4 中医证型诊断标准

2．4．1 肾气不足型主症

2．4．2 肾气不足型次症

2．4．3 舌脉

2．5 纳入标准

2．6 排除标准(入组前的选择)

2．7 剔除及脱落标准(实验中的淘汰)

2．8 研究方法与临床研究流程路线图

2．8．1 各组的药物及用药情况

2．8．2 排石的疗效标准

2．8．3 数据保存

2．8．4 统计学方法

2．9 结果

2．9．1 纳入研究受试对象一般资料分析

2．9．2 治疗结果

第三章 实验研究

3．1 引言

3．2 实验动物

3．3 药物、试剂及仪器

3．4 实验场所、规格与条件

3．5 实验方法

3．5．1 分组、造模及给药

3．5．2 实验取材及检测

3．6 实验结果

3．6．1 各组大鼠肾脏组织总SOD活力组间比较情况

3．6．2 各组大鼠肾脏组织总MDA含量组间比较情况

3．6．3 各组大鼠血SOD活力组间比较情况

3．6．4 各组大鼠血MDA含量组间比较情况

3．6．5 各组大鼠血Cr肌酐组间比较情况

3．6．6 各组大鼠血尿素氮BUN组间比较情况

3．6．7 各组大鼠血清Ca2+离子组间比较情况

3．6．8 各组大鼠肾脏病理切片草酸钙结晶沉积程度的比较

3．6．9 各组大鼠肾脏组织中IKB的Western blotting实验结果组间比较

3．6．10 各组大鼠肾脏组织中IKK的Western blotting实验结果组间比较

3．6．11 各组大鼠肾脏组织中NF-κB／P65的Western blotting实验结果组间比较

3．6．12 各组大鼠肾脏组织中IL-1β含量的ELISA酶联免疫检测法实验结果组间比较

第四章 分析与讨论

4．1 济生肾气丸对肾气不足型肾结石的临床观察

4．2 济生肾气丸治疗肾气不足型肾结石大鼠的动物实验

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢