补中益气汤经肠道SGLT1/NHE3调控作用治疗脾虚泄泻证的机制研究

摘要

研究目的：
　　补中益气汤出自李东垣的《内外伤辨惑论》，是临床上常用于脾胃气虚，清阳下陷等证，为补中益气、升阳举陷的代表方。白术是补中益气汤主要组成药物之一，白术内酯Ⅰ(AtractylenolideⅠ)是白术健脾的主要有效成分之一，以往研究发现补中益气汤及白术内酯Ⅰ对脾虚泄泻患者和（或）动物的消化、吸收等功能有着促进作用。本实验拟通过建立脾虚泄泻大鼠模型及Caco-2细胞模型，探讨脾虚泄泻大鼠小肠葡萄糖吸收障碍及SGLT1/NHE3通路的变化，并观察补中益气汤、白术内酯Ⅰ对其的干预作用，以期从分子水平阐明补中益气汤治疗脾虚泄泻的作用机制。
　　研究方法：
　　实验研究以“大黄+利血平+控制饮食”多因素法建立脾虚泄泻大鼠模型，随机分组为正常对照组、脾虚泄泻模型组和补中益气汤低、中、高剂量组，观察大鼠造模及给药后一般情况变化、泄泻指数、D-木糖排泄率及小肠葡萄糖吸收含量，HE染色观察大鼠小肠黏膜病理学改变，westernblot法检测钠依赖性葡萄糖转运体(SGLT1)、葡萄糖转运体2(GLUT2)、钠氢交换体3(NHE3)、P38MAPK、P-P38MAPK、MAPKAPK2、P-MAPKAPK2、Akt2、P-Akt2、Ezrin、P-Ezrin蛋白的表达，荧光定量RT-PCR检测钠依赖性葡萄糖转运体(SGLT1)、葡萄糖转运体2(GLUT2)、钠氢交换体3(NHE3) mRNA的表达。
　　白术内酯Ⅰ对SGLT1/NHE3及MLCK/MLC通路的影响:采用Caco-2细胞模型，用根皮苷(PZ，Phlorizin)、SB203580、NSC668394分别阻断SGLT1、P38MAPK、Ezrin后，再加入白术内酯Ⅰ进行干预，观察其对NHE3和（或）MLCK、P-MLC磷酸化的影响。
　　研究结果：
　　1.大鼠体重变化及尿D-木糖排泄率:造模前，正常对照组与造模组体质量及尿D-木糖排泄率无明显差异(P＞0.05)，造模结束后，造模组的体重及尿D-木糖排泄率明显下降，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。给予补中益气汤治疗后，给药组体重尿D-木糖排泄率均有所增加，但体重变化各组之间差异无统计学意义(P＞0.05);尿D-木糖排泄率以补中益气汤高剂量组改善最为明显，与模型组比较有统计学差异(P＜0.05)。
　　2.大鼠腹泻指数及小肠葡萄糖吸收量:造模后，大鼠腹泻指数升高，葡萄糖吸收量下降(P＜0.05)。给与补中益气汤后，各给药组腹泻症状均逐渐减轻，腹泻指数降低，小肠葡萄糖吸收量有所提高，且呈剂量依赖性，其中以补中益气汤中剂量或高剂量组较为明显(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.小肠粘膜病理学及Na+-K+ATP酶活性的改变:模型组大鼠小肠绒毛形态部分损伤，上皮细胞缺失，间质炎症细胞浸润，小肠绒毛的高度及宽度均明显降低(P＜0.01)，且小肠粘膜Na+-K+ATP酶活性下降(P＜0.01)。经补中益气汤干预后小肠粘膜修复明显，绒毛的高度及宽度均可见升高(P＜0.01)，小肠粘膜Na+-K+ATP酶活性增强，且呈剂量依赖性，其中以补中益气中、高剂量组疗效较好(P＜0.01)。
　　4.补中益气汤对脾虚泄泻大鼠SHLT1/NHE3通路相关蛋白及基因表达的影响:模型组大鼠小肠黏膜中SGLT1、GLUT2、NHE3mRNA及蛋白表达量降低(P＜0.01或P＜0.05)，P38MAPK/Ezrin通路相关蛋白P38MAPK、MAPKAPK2、Akt2、Ezrin的表达量在各组之间无明显变化(P＞0.05)，但P-P38MAPK、P-MAPKAPK2、P-Akt2、P-Ezrin蛋白表达量较正常组减低(P＜0.01)，给予补中益气汤后，SGLT1、GLUT2、NHE3mRNA及蛋白，P-P38MAPK、P-MAPKAPK2、P-Akt2、P-Ezrin蛋白表达量均有所提高(P＜0.05)，且以高剂量组最为明显。
　　5.白术内酯Ⅰ对Caco-2细胞SHLT1/NHE3通路相关蛋白表达的影响:在使用PZ抑制SGLT1后，Caco2细胞SGLT1、NHE3mRNA和蛋白表达下调(P＜0.05)，P38MAPK/EZRIN通路磷酸化减少，白术内酯Ⅰ可使SGLT1和NHE3mRNA和蛋白表达增加(P＜0.05)，且能使SGLT1通路下游蛋白P38MAPK、MAPKAPK、Akt2、Ezrin磷酸化增加(P＜0.01或P＜0.05)，加入SB203580或NSC668394阻断P38MAPK或Ezrin蛋白后，NHE3mRNA及蛋白表达下调(P＜0.05)，给予白术内酯Ⅰ后NHE3表达增加(P＜0.01)，说明白术内酯Ⅰ可能不是通过P38MAPK、Ezrin来促进NHE3的表达。
　　6.白术内酯Ⅰ对Caco-2细胞MLCK/MLC通路相关蛋白表达的影响:在使用PZ抑制SGLT1后，Caco2细胞MLCKmRNA及蛋白表达减少，MLC磷酸化降低(P＜0.01或P＜0.05)，给予白术内酯Ⅰ后MLCK表达及MLC磷酸化增加(P＜0.05)，说明白术内酯Ⅰ可通过促进SGLT1的表达上调MLCK表达及MLC磷酸化，加入SB203580阻断P38MAPK后，MLCKmRNA及蛋白表达减少，MLC磷酸化降低(P＜0.05)，给予白术内酯Ⅰ后MLCK表达增加(P＜0.01)，说明白术内酯Ⅰ可能不是通过P38MAPK来促进MLCK表达及MLC磷酸化增加。
　　研究结论：
　　1.脾虚泄泻大鼠体质量及D-木糖排泄率、葡萄糖吸收率较对照组下降，腹泻指数升高，小肠绒毛损伤及Na+-K+ATP酶的活性的降低。补中益气汤可以改善脾虚泄泻大鼠腹泻症状，增加脾虚大鼠的体质量、D-木糖排泄率及葡萄糖吸收量，促进脾虚泄泻大鼠小肠粘膜损伤的修复及肠粘膜Na+-K+ATP酶的活性。
　　2.脾虚泄泻大鼠SGLT1和GLUT2、NHE3蛋白和mRNA的表达下调，P38MAPK/Ezrin通路中蛋白的磷酸化降低，补中益气汤能通过提高SGLT1蛋白的表达，增加P38MAPK/Ezrin通路的磷酸化，促进NHE3蛋白表达增加，这可能是补中益气汤治疗脾虚泄泻的机理之一。
　　3.在Caco-2细胞中，使用根皮苷(PZ，Phlorizin)抑制SGLT1后出现SGLT1、NHE3mRNA及蛋白表达下调，P38MAPK/Ezrin通路中蛋白的磷酸化降低，抑制P38MAPK及Ezrin可出现NHE3mRNA及蛋白表达的降低，白术内酯Ⅰ可促进SGLT1的表达，进而促进P38MAPK/Ezrin通路的磷酸化，增加NHE3的表达。
　　4.在Caco-2细胞中，抑制SGLT1或P38MAPK出现MLCKmRNA和蛋白表达下调，MLC磷酸化降低，白术内酯Ⅰ可通过增加SGLT1表达促进MLCK的表达及MLC的磷酸化。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献综述

第一节 脾虚与胃肠道相关性的研究进展

一、脾虚与胃肠激素

二、脾虚与胃肠动力

三、脾虚与胃肠粘膜

四、脾虚与肠道菌群

五、脾虚与消化、吸收及营养代谢

第二节 小肠SGLT1及CLUT2研究进展

第三节 慢性腹泻的常见机制研究

一、水和电解质的吸收及分泌

二、肠神经系统

三、胆汁酸吸收不良

四、细菌过度增长

五、内分泌肿瘤

六、其他原因

第二章 实验研究

第一节 脾虚泄泻大鼠模型的建立

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二节 补中益气汤对脾虚泄泻大鼠葡萄糖吸收的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三节 补中益气汤对脾虚泄泻大鼠肠粘膜Na+-K+ATP酶活性及病理改变的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第四节 补中益气汤对脾虚泄泻大鼠SGLT1／NHE3通路的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第五节 白术内脂Ⅰ对Caco-2细胞SGLT1／NHE3通路的影响

实验一 不同浓度白术内酯Ⅰ对Caco-2细胞SGLT1蛋白表达的影响

实验二 白术内酯Ⅰ对Caco-2细胞SGLT1／NHE3和MLCK-MLC通路表达的影响

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文及参与课题情况

致谢