基于肺泡巨噬细胞吞噬功能缺陷探讨肺康方干预COPD的机制及疗效观察研究

摘要

目的:
　　慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种复杂的慢性全身性疾病，随着自然病情发展，COPD易反复急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)，而AECOPD频繁发作是导致COPD患者住院率高、致残率高、肺功能下降速度快、生命质量低及经济负担重的主要原因。近年研究发现肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)吞噬功能缺陷是COPD易反复肺部感染及急性加重的重要病理因素，且其吞噬功能缺陷与TLR(Toll-likereoeptor)/NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)信号转导通路调控有关，而中药复方对COPD肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage，AM)吞噬功能缺陷的机制研究较少。因此本研究试图从临床观察及实验研究方面入手，通过建立COPD大鼠模型，设置正常组、COPD大鼠模型组、肺康方低、中、高剂量组及阳性对照组（地塞米松组），围绕肺泡巨噬细胞(AM)吞噬病原体、AM吞噬功能的受体调控机制两方面，探讨肺康颗粒对其干预作用及其作用机制;同时观察肺康方对COPD稳定期肺脾气虚患者中医证候积分、肺功能、急性加重次数及程度、生存质量、诱导痰中IL-1β，TNF-a，IL-6、及IL-17表达的影响。为丰富与发展中医药防治慢性阻塞性肺疾病稳定期的治则治法进行有益的科学探索。
　　方法:
　　1.临床观察:将符合纳入标准的患者随机分为肺康方治疗组及西医对照组。肺康组予肺康方（配方颗粒）加噻托溴铵粉吸入剂治疗，对照组用噻托溴铵粉吸入剂治疗，疗程3个月，观察两组中医证候积分、肺功能、急性加重次数及程度、简化圣乔治呼吸问卷(St.George Respiratory Questionnaire，SGRQ)及六分钟步行距离(Six Minutes Walking Distance，6MWD)、诱导痰中IL-1β、TNF-a、IL-6、及IL-17表达的变化情况。
　　2.动物实验:将60只健康雄性SD大鼠随机分成6组，每组10只，分别为正常对照组、COPD模型组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组、地塞米松组（阳性对照），采用持续熏烟(20周)联合气管滴注脂多糖(LPS)法建立大鼠COPD模型。在连续熏烟4周后，予以肺康颗粒溶剂和地塞米松干预16周。
　　结果:
　　1.临床观察:
　　(1)经SPSS19.0统计学分析处理，两组患者年龄、性别、身体质量指数(Body Mass Index，BMI)、吸烟状况、病程、病情程度、肺功能等方面，无统计学差异，具有可比性(P＞0.05)。
　　(2)对中医证候积分的影响:治疗3月后，肺康组各项症状与治疗前相比较，均有统计学差异(P＜0.05);对照组仅在咳嗽、咳痰、喘息方面，同治疗前相比，有统计学差异(P＜0.05)，其余指标均无明显变化;两组治疗后相比较，除了咳嗽、喘息外，余指标均有统计学差异(P＜0.05)。
　　(3)对急性加重次数及程度的影响:治疗期间肺康组与对照组在急性加重次数及急性加重程度方面，无统计学差异(P＞0.05)。
　　(4)对肺功能的影响:治疗3月后，两组分别与各自治疗前在舒张试验前FEV1、FVC、IC相比，均有统计学差异(P＜0.05)，舒张试验后各项指标相比较，无统计学差异(P＞0.05);且两组组间舒张试验前后各项指标比较，无统计学差异(P＞0.05)。
　　(5)对生存质量的影响:治疗3月后，肺康组与对照组在简化SGRQ总分、症状部分评分、活动部分评分、疾病影响部分评分均较治疗前明显下降，有统计学差异(P＜0.05)，且肺康组在症状部分、活动部分评分下降明显低于对照组，有统计学差异(P＜0.05)。
　　(6)对六分钟步行距离的影响:治疗3月后，肺康组与治疗组均较治疗前升高，但肺康组较治疗前比较，具有统计学差异(P＜0.05);两组组间比较，肺康组升高更加明显，有统计学差异(P＜0.05)。
　　(7)对诱导痰中IL-1β、TNF-a、IL-6、及IL-17表达的影响:治疗3月后，肺康组与治疗组均较治疗前下降明显，有统计学差异(P＜0.05);两组组间比较，肺康组能更显著降低TNF-a、IL-17含量，有统计学差异(P＜0.05)。
　　2.动物实验:
　　(1)大鼠一般状况:正常对照组大鼠被毛洁白光滑，活动度及食欲好，呼吸频率均匀;COPD组大鼠在造模期间被毛由洁白、光滑逐渐变得暗黄及干枯，活动度以及食欲逐渐减少，呼吸频率逐渐增加，有的大鼠出现了打喷嚏的症状，体重无明显变化。
　　(2)肺功能:与正常对照组相比，COPD模型组大鼠肺功能PIF、PEF和EF50等指标均显著下降，有统计学差异(P＜0.01);低、中、高剂量的肺康颗粒与COPD模型组比较，能改善PIF、PEF和EF50等指标(P＜0.05)，并且改善作用与剂量呈现一定的依赖关系，低剂量肺康颗粒的改善作用较弱，中剂量肺康颗粒的作用次之，高剂量的肺康颗粒改善作用最强;而地塞米松组与COPD模型组比较，无统计学差异(P＞0.05)。
　　(3)肺组织HE染色:正常对照组大鼠镜下可见肺泡腔内未见炎性渗出物，肺泡腔结构正常，未见病理性扩大，COPD组大鼠肺泡壁变薄、过度膨胀，肺泡数目减少，部分可见肺泡融合、肺大疱形成。地塞米松阳性对照组可见肺泡结构基本恢复正常，不同剂量中药组治疗后肺泡结构均有所恢复。
　　(4)BALF细胞总数及细胞分类:经肺康颗粒或者地塞米松药物干预后，各类炎症细胞占白细胞总数的比例无明显变化，但绝对数量较药物干预前（即COPD组）明显减少，其中以地塞米松组大鼠BALF中的炎症细胞数量减少最为明显，高剂量中药组次之，接着是中剂量中药组，而低剂量中药组BALF中炎症细胞数量减少不明显。
　　(5)肺泡巨噬细胞吞噬能力:与正常对照组相比，COPD组大鼠肺泡巨噬细胞的吞噬细菌率和平均荧光强度(MFI)均较明显降低(P＜0.01);肺康颗粒治疗组和地塞米松治疗组的肺泡巨噬细胞吞噬FITC-E.coli阳性率和MFI均较COPD组的显著升高，具有统计学差异(P＜0.01);地塞米松组的效果与高剂量中药组的效果相当，无统计学差异(P＜2.02;P＜0.69)。
　　(6)BALF、肺泡巨噬细胞中炎症因子表达:与正常对照组相比，中剂量组次之，低剂量组最弱;此外，高剂量中药组对COPD大鼠肺泡巨噬细胞分泌，TNF-α，IL-6，IL-17的下调作用与地塞米松组相似(P=0.324;P=0.208;P=0.957)，而IL-1β的比较有统计学差异(P=0.000)。
　　(7)免疫组化结果:与正常对照组相比，不同剂量的中药均能抑制COPD大鼠肺脏组织TNF-α，IL-6和P65蛋白的表达，且这种抑制作用与中药浓度呈正相关。
　　(8)Western blot结果:①大鼠肺泡巨噬细胞:与正常对照组相比，COPD模型组大鼠肺泡巨噬细胞中胞浆蛋白TLR4，TLR2和Ikappa B的表达量均下降，但是胞浆蛋白p-IkappaB和胞核蛋白P65的表达水平上升。②大鼠肺组织:与正常对照组相比，COPD模型组大鼠肺脏组织中胞浆蛋白TLR4，TLR2和Ikappa B的表达量均下降，同时胞浆蛋白p-IkappaB和胞核蛋白P65的表达上升。
　　(9)qPCR结果:①大鼠肺泡巨噬细胞:与正常对照组相比，COPD模型组大鼠TNF-α和IL-6mRNA表达量均明显上调，而TLR4和TLR2mRNA表达水平则明显下调。②大鼠肺组织:与正常对照组比较，COPD模型组大鼠肺组织中TNF-α和IL-6mRNA的表达量均明显升高(p＜0.001)，而TLR4和TLR2mRNA表达则明显下调(P＜0.001)。
　　结论:
　　1.临床观察:
　　(1)肺康方能明显改善COPD稳定期肺脾气虚证患者的临床症状，尤其在咳痰、易感冒、自汗、倦怠乏力、食少纳呆、腹胀、大便异常等症状方面。
　　(2)肺康方能一定程度改善患者肺功能、减少急性发作次数。
　　(3)肺康方能改善患者生存质量，尤其在缓解呼吸道症状及提高日常活动能力等方面。
　　(4)肺康方能明显降低患者诱导痰中炎症因子IL—1β，TNF-α，IL-6，IL-17的水平。考虑其发挥临床疗效作用，可能与其通过降低气道炎症因子水平，从而减轻气道炎症反应有关。
　　2.动物实验:
　　(1)持续熏烟(20周)联合气管滴注脂多糖(LPS)法可诱导大鼠发生COPD病理改变以及证实COPD存在肺泡巨噬细胞吞噬功能缺陷。
　　(2)肺泡巨噬细胞发挥吞噬作用与TLR/NF-κB信号转导通路有关，通过调控TLR/NF-κB信号转导通路能在一定程度上改善肺泡巨噬细胞的吞噬功能，调节炎症基因的表达，从而减轻气道炎症反应。
　　(3)肺康方可增强肺泡巨噬细胞吞噬功能，抑制炎症基因表达，减轻气道炎症反应，可能是通过调控TLR/NF-κB信号转导通路的转导而实现的。
　　3.以“培土生金”理论指导的中药复方肺康方能通过增强肺泡巨噬细胞的吞噬能力而达到改善COPD的作用。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 文献研究

1． 中医对慢性阻塞性肺疾病的研究概况

1．1 历史渊源及病名

1．2 病因

1．3 病机

1．4 现代中医学对病因病机的研究

1．5 辨证论治

1．6 证型研究

1．7 中医对慢阻肺的治疗原则

2．1 COPD概念的演变

2．2 病因

2．3 发病机制

2．4 诊断与初步病情评估

2．5 治疗与管理

2．6 COPD生存质量评估

3．COPD与肺泡巨噬细胞及其吞噬调控机制

3．1 COPD与肺泡巨噬细胞

3．2 肺泡巨噬细胞吞噬调控机制

3．3 肺泡巨噬细胞吞噬信号传导通路

3．4 治疗药物

第二部分 临床研究

1． 临床资料

1．1 病例来源

2．研究方法

2．1 分组方法

2．3 治疗疗程

2．4 观察指标

2．5 数据处理

3．研究结果

3．1 一般资料分析

3．2．临床研究结果

4．讨论

4．1 立题依据

4．2．研究结果分析

5．结论

6．自我评价和展望

第三部分 实验研究

1．主要实验材料

1．3 主要仪器设备

2．实验方法

2．1 方药成分及使用

2．3 动物分组及处理

2．4 样本采集及指标观察

3．实验结果

3．1 COPD大鼠模型的建造

3．2 肺康颗粒对大鼠肺泡灌洗液的影响

3．3 肺康颗粒对大鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响

3．4 肺康颗粒对大鼠肺脏组织的影响

4．讨论

4．1 COPD大鼠模型的建造

4．2 COPD与肺泡巨噬细胞吞噬功能、分泌功能

4．3 肺康颗粒对肺泡巨噬细胞吞噬功能、分泌功能的干预作用

4．4 肺康颗粒对TLR／NF—κ B信号通路的影响

5．结论

6．不足与启示

6．1 不足之处

6．2启示

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢