黄粉虫纤溶活性蛋白免疫原性与抗血栓作用的研究

摘要

黄粉虫(Tenebrio molitor)又叫面包虫，隶属于鞘翅目，拟步行虫科，粉虫甲属。原产北美洲，上世纪50年代由苏联引进我国。黄粉虫富含多种营养成分，其干品含蛋白质高达50％以上，被誉为“蛋白质饲料宝库”，此外还富含磷、钾、铁、钠、铝等常量元素和多种微量元素以及16种氨基酸。鉴于该虫具有生存能力和适应能力强、生长发育快、养殖成本低等优点，日益受到人们的青睐，目前在我国已成为继养蚕、养蜂业外的第三大养殖业。
　　随着我国人民生活水平的不断提高，健康长寿已越来越成为人们的迫切需要。研究表明，血栓性疾病是近年来威胁人类健康的最严重疾病之一，其致残率和死亡率极高，且该病的发病率与死亡率呈上升的趋势，因此，预防血栓形成及血栓病的有效治疗对于维护公众健康，提高人类生存质量有着极为重要的意义。
　　几年来，本实验室从黄粉虫体内分离纯化到一种具有强溶血栓活性的蛋白。本研究期望进一步对该活性蛋白的一系列理化性状以及免疫原性进行检测，为将其开发成为一种高效、安全的治疗药物打下基础。
　　本研究采用匀浆浸提、硫酸铵分段盐析、阴离子交换层析等系列生化提取制备技术，从黄粉虫幼虫体内分离纯化得到一种纤溶活性蛋白(Tenebrio Fibrinolyric Proteins，TFP)，经纤维平板法检测其具有很强的纤溶作用，经Brad fore法测得该蛋白浓度为7.7905mg·mL-1，聚丙烯酰胺凝胶电泳测出其相对分子量约为54.3kD。
　　为了探讨TFP的免疫原性，本文以小鼠为实验对象，采用皮下多点注射法进行免疫试验，取血后分离血清，采用间接ELISA法检测小鼠血清中的抗体含量及抗体效价。研究结果显示黄粉虫纤溶活性蛋白具有和尿激酶相似的免疫原性，末次免疫后产生的抗体效价为1∶640。说明TFP具有一定的免疫原性。
　　为了研究TFP在体内的抗血栓作用，将TFP作用于角叉菜胶所致血栓的小鼠模型和正常小鼠，结果表明TFP能够抑制角叉菜胶所致的小鼠尾部血栓的形成，;能明显延长正常小鼠凝血酶时间(TT)，增强其组织型纤溶酶原激活剂(t-AP)的活性、抑制其组织型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)的活性。显示了黄粉虫纤溶活性蛋白具有良好的体内抗血栓作用。

目录

摘要

缩写

第一章 绪论

1．1 血栓性疾病概述

1．2 血栓的形成

1．2．1 凝血系统和纤溶系统

1．2．2 血栓形成的条件

1．2．3 血栓的形成过程

1．3 血栓的种类

1．3．1 白色血栓

1．3．2 红色血栓

1．3．3 混合血栓

1．3．4 透明血栓

1．4 抗血栓药物研究进展

1．4．1 抗血小板药物

1．4．2 抗凝血药物

1．4．3 溶血栓药物

1．5 黄粉虫研究与利用现状

1．5．1 黄粉虫在国内的研究利用现状

1．5．2 黄粉虫在国外各个领域的研究利用现状

1．6 论文的研究意义及主要研究内容

1．6．1 研究意义

1．6．2 研究内容

第二章 黄粉虫活纤溶性蛋白提取分离纯化及鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 实验材料和试剂

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 黄粉虫纤溶活性蛋白的分离

2．2．2 黄粉虫纤溶活性蛋白的纯化

2．2．3 纤溶活性的测定

2．2．4 蛋白浓度的检测

2．2．5 黄粉虫活性蛋白分子量检测

2．3 实验结果

2．3．1 黄粉虫纤溶活性蛋白的分离纯化

2．3．2 黄粉虫纤溶活性蛋白中蛋白质含量测定

2．3．3 黄粉虫纤溶活性蛋白分子量的测定

2．4 本章小结

第三章 黄粉虫纤溶活性蛋白免疫原性的研究

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 实验试剂及仪器

3．1．3 ELISA相关试剂的配制

3．2 实验方法

3．2．1 动物分组及免疫实验

3．2．2 血清的制备

3．2．3 抗体含量的检测

3．2．4 抗体效价的检测

3．3 实验结果

3．3．1 抗体含量的检测结果

3．3．2 抗体效价的检测结果

3．4 本章小结

第四章 黄粉虫纤溶活性蛋白抗血栓作用的研究

4．1 实验材料

4．1．1 实验动物

4．1．2 实验试剂及试剂盒

4．1．3 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 黄粉虫纤溶活性蛋白对小鼠凝血系统的影响

4．2．2 黄粉虫纤溶活性蛋白对小鼠纤溶系统的影响

4．2．3 黄粉虫纤溶活性蛋白对角叉菜胶致小鼠尾部血栓形成的影响

4．2．4 实验数据分析及处理

4．3 实验结果

4．3．1 黄粉虫纤溶活性蛋白对小鼠凝血系统的影响

4．3．2 黄粉虫纤溶活性蛋白对小鼠纤溶系统的影响

4．3．3 黄粉虫纤溶活性蛋白对角叉菜胶致小鼠尾部血栓形成的影响

4．4 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

声明

致谢