光甘草定提取纯化及抗银屑病作用和机理研究

摘要

银屑病由多基因遗传、多环境因素刺激诱导的免疫异常性炎症性增生性皮肤病，主要表现IL-23/IL17炎症反应轴上相关因子的调节。市场上多数治疗银屑病的药物如糖皮质激素、维生素A衍生物、水杨酸、喜树碱、雷公藤内酯等，长期使用对机体肝、肾和免疫功能有严重损坏作用。近年学者提出：“中医与中西医结合是防治牛皮癣（银屑病）的方向”。光甘草定是从甘草植物提取出的天然产物，已有百年的药用历史，在抗炎抗氧化和治疗痤疮等方面有广泛的应用，此外，光甘草定长期作为护肤品成分，本文以探索光甘草定在治疗银屑病的方面的作用和机理研究为重点。具体研究内容和结果如下：
　　1）光甘草定的分离纯化及结构鉴定。本文采取用乙酸乙酯回流2h，料液比为1:10的提取方法，通过两次层析分离，最后用半制备液相得到光甘草定纯品。通过高效液相和核磁共振进行纯度及结构确认。建立高效液相快速检测光甘草定含量方法。
　　2）光甘草定的抗银屑病活性研究。首先建立咪喹莫特乳剂（IMQ）诱导的小鼠银屑病耳廓肿胀模型和背部皮肤破损模型。其次，根据光甘草定（PT）在人体皮肤用药标准设置不同浓度进行给药。1）对小鼠耳廓红肿程度的进行表观观察以及打孔称重后发现，在PT（30g/kg、15g/kg）时明显抑制效果，抑制率高达68.37％和56.98%。2）对小鼠背部皮肤红肿、鳞屑、肿胀程度的进行PAIS评分，绘制趋势线以观察各组小鼠皮损的变化情况，发现PT（30g/kg、15g/kg）组小鼠具有明显的抑制效果。最后，针对上述结果采用了 HE染色方法从组织形态方面观察组织肿胀和损伤作用，研究发现，正常组的耳朵和背部皮肤的组织形态表现正常；单独使用IMQ时，小鼠耳朵和背部皮肤角质层明显增厚和炎性细胞浸润增多（细胞固缩）；FK组和PT组组均有一定的抑制作用，通过对比发现PT（30g/kg、15g/kg）组小鼠的耳朵和背部皮肤切片的变化更明显，包括耳朵和皮肤肿胀程度明显降低（趋于正常组）以及细胞核与细胞质的比例明显变小等，活性优于阳性药。
　　（3）光甘草定的抗银屑病机理研究。收集上述的小鼠银屑病组织样品，提取蛋白和转录基因。通过荧光定量PCR（RTF-QPCR）和免疫组织化学法（IHC）检测组织中各目标因子的表达情况。实验结果发现，IMQ单独使用时小鼠皮肤中的P65、IFN-γ、IL-17A、IL-6、COX-2、IL-22、IL-23、CD4、CD8?的表达量明显的增加，各PT组对这些炎症介质均有一定程度的抑制效果，其中高浓度30g/kg组的抑制作用最强，并且比阳性药好。由此可见，光甘草定是通过抑制上IL-23/IL17炎症反应轴以多个炎症因子表现出抗银屑病的作用。
　　综上所述，本论文从光甘草定提取检测以及抗银屑病活性和病理方面研究，可为光甘草定在银屑病中的应用提供理论和实验依据。

目录

第一章 绪论

1.1光甘草定的研究进展

1.1.1 光甘草定的概述

1.1.2光甘草定的提取、分离及纯化研究进展

1.1.3光甘草定的生物活性研究进展

1.2银屑病及其药物研究进展

1.2.1银屑病分类及其发病机理

1.2.2银屑病的药物研究进展

1.3本实验研究目的、内容和意义

1.3.1目的和意义

1.3.2本论文研究的内容

第二章 光甘草定提取纯化及结构鉴定

2.1引言

2.2实验耗材

2.2.1实验仪器

2.2.2实验试剂

2.3实验方法

2.3.1光甘草定的提取及纯化

2.3.2光甘草定含量检测

2.3.3光甘草定纯品确认

2.4结果与讨论

2.5本章小结

第三章光甘草定抗银屑病机理研究

3.1引言

3.2实验仪器与溶剂

3.2.1实验仪器

3.2.2实验耗材与试剂

3.3实验方法

3.3.1构建小鼠银屑病模型

3.3.2苏木精-伊红染色实验

3.3.3实时荧光定量PCR

3.3.4免疫组化

3.4结果与讨论

3.4.1光甘草定定对小鼠银屑病模型的作用

3.4.2光果甘草定抗银屑病的机理研究

3.5本章小结

结论与展望

参考文献

声明

致谢