抗菌肽DCD-1L基因在毕赤酵母中的表达及其突变文库表达质粒载体的构建

摘要

DCD是从人汗腺中发现的抗菌肽,DCD-1L是它的衍生物,能够有效抵抗革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌,具有广谱的抗菌活性。它与抗生素不同,不会在生物体内富集,也不会诱导产生耐药菌株,是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。因此本文利用重叠延伸法获得抗菌肽 DCD-1L基因,将其在毕赤酵母GS115中表达,初步鉴定表达产物的活性,并且建立DCD-1L基因的随机突变库,构建突变文库表达载体,对高效表达株的筛选方法进行了初探。方法如下:(1)根据 DCD-1L的氨基酸序列及酵母偏好密码子设计基因序列,以重叠延伸 PCR制备目的基因,然后将其重组到含有α-factor信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pPICZα-A中,测序验证重组质粒构建的正确性,SacⅠ线性化后电转化到Pichia pastoris GS115中,利用抗生素Zeocin筛选出阳性克隆,重组质粒在AOX1(醇氧化酶)启动子调控下进行分泌型表达,发酵上清做抑菌圈实验,并用 SDS-PAGE鉴定表达多肽。(2)利用含随机突变序列的两条DCD-1L基因片段重叠延伸PCR法制备突变基因,将其构建到含有强启动子 GAP和α-factor信号肽序列的载体pGAPZα-C中,重组质粒 BspHⅠ线性化后转化到蛋白酶缺陷株 Pichia pastoris SMDII68中,得到突变库,利用平板影印法筛选高活性突变株。所得结果如下:
　　1、获得了DCD-1L基因及其突变体。
　　2、将DCD-1L基因克隆到载体pPICZα-A上,筛选、检测阳性转化子并测序,结果与DCD-1L基因序列一致。
　　3、将重组载体电转化Pichia pastoris GS115,表达上清经SDS-PAGE电泳检测可见6KD的条带。
　　4、通过抑菌圈实验,表达上清具有抑菌活性。
　　5、将 DCD-1L突变体克隆到载体 pGAPZαC中,并转化到 Pichia pastoris SMDII68中,高效突变株筛选正在进行中。
　　通过上述结果得到以下结论:成功获得了DCD-1L基因并构建了重组载体;抗菌肽基因已成功表达且表达产物具有生物活性;同时成功构建了DCD-1L基因随机突变文库,为下一步筛选高表达突变株奠定了基础。

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第一章 综述

1、抗菌肽

2抗菌肽DCD-1L

3抗菌肽基因的克隆表达策略

4.毕赤酵母表达系统

参考文献

第二章 抗菌肽DCD-1L基因在毕赤酵母GS115中的表达

1前言

2 试剂及仪器

3、方法

4 结果与分析

5讨论

参考文献

第三章 DCD-1L随机突变文库及其表达载体的构建和高效表达菌株筛选方法初探

1前言

2 试剂及仪器

3、方法

4结果与分析

5 讨论

参考文献

结论

附录1：主要溶液配制方法

附录2：质粒pPICZα系列图谱

附录3：质粒pPICZα-A多克隆位点

附录4：质粒pGAPZα系列图谱

附录5：质粒pGAPZα-C多克隆位点

附录6：重组质粒测序结果（5′AOX）

重组质粒测序结果（3′AOX）

硕士期间发表论文及参与课题：

致谢