马氏珠母贝抗多毛类寄生虫病候选基因的筛选

摘要

马氏珠母贝[Pinctadamartensii(Dunker)]，又称合浦珠母贝，是培育海水珍珠的主要贝类，已成为广东、广西和海南等沿海部分地区的支柱产业。马氏珠母贝养殖业一直受到多毛类寄生病--凿贝才女虫(Polydoraciliata)的危害，这种多毛类寄生病极大地影响了海水珍珠产量和质量，严重地制约着我国珍珠养殖业的健康发展。因此，本研究通过抗病基因的筛选，为防治多毛类寄生虫病提供了一种新方法。 本文以感病和健康马氏珠母贝的mRNA为实验材料，构建了马氏珠母贝感病SMARTcDNA血液文库1097个克隆，健康SMARTcDNA血液文库1254个克隆。将地高辛标记的总RNA为探针，筛选文库的克隆，共得到416个阳性克隆。按照显色光密度相差5倍的原则，在阳性克隆中共挑选差异克隆66个，其中感病的马氏珠母贝血液文库中呈阳性的克隆有33个，健康马氏珠母贝血液文库中呈阳性的克隆也有33个。 将挑选的66个差异克隆测序，得到58个测序结果，有8个测序失败。将测序获得的序列在NCBI上进行在线序列分析(去除载体序列、BLASTx、BLASTn、ORF、查找与数据库中其它物种已知序列的同源性、搜索开放阅读框、推断可能的氨基酸序列)，并用CLustalX1.8软件进行序列比对。结果显示它们分别与29个已知基因具有不同程度的相似性，并根据这29个的基因片段设计了26个基因特异性引物，做RT-PCR。结果发现，赖氨酸羟化酶基因、Profilin基因、细胞色素氧化酶基因、金属硫蛋白基因、检验点激酶基因、蛋白激酶基因、马氏珠母贝的核糖体基因和NCBI数据库已知序列没有同源性的未知蛋白等在马氏珠母贝肝、胃、血液、鳃、足、心脏、外套膜等组织有不同的组织表达差异，为抗病基因筛选奠定了基础。

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英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1 珍珠养殖业的历史

1.2 珍珠养殖业状况及病原危害

1.3 多毛类寄生虫病--凿贝才女虫

1.3.1凿贝才女虫的分类及危害

1.3.2凿贝才女虫的防治方法

1.4 抗性候选基因的克隆

1.4.1经典的抗病基因克隆方法--转座子标签和图位克隆技术

1.4.2差异表达基因的分离方法

1.5 本研究的目的和意义

第二章材料和方法

2.1 主要仪器设备

2.2 试剂

2.2.1试剂盒

2.2.2其他试剂

2.2.3载体及菌株

2.3 实验材料

2.4 试验方法

2.4.1 RNA的提取

2.4.2 RNA反转录成cDNA

2.4.3 SMART cDNA质粒文库的构建

2.4.4斑点杂交

2.4.5阳性克隆检出、测序分析

2.4.6设计差异基因引物

2.4.7 α-tubulin引物调整cDNA模板浓度

2.4.8 RT-PCR分析基因的表达

第三章实验结果

3.1马氏珠母贝total mRNA的提取

3.2马氏珠母贝SMART cDNA

3.3马氏珠母贝SMART cDNA质粒文库

3.4斑点杂交

3.5差异大的克隆测序、分析

3.6马氏珠母贝差异基因的组织表达特征

第四章讨论

4.1 马氏珠母贝mRNA提取及构建文库

4.2 DIG标记的核酸分子杂交

4.3阳性克隆的检出及测序分析

4.4基因组织表达差异的分析

4.4.1 RT-PCR分析基因组织特异性表达

4.4.2 Southern杂交和虚拟Northern杂交

结论

参考文献

致谢

作者在读期间所发表论文