香蕉、胡椒和落葵上黄瓜花叶病毒分离物的血清学及分子鉴定

摘要

黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员。CMV是世界性分布范围最广、发生最普遍的植物病毒之一，可由蚜虫和机械方式传播，侵染100科1200多种单、双子叶植物，对农业生产危害较大。海南热带气候条件适合植物生长，亦提供了病毒传播介体孳生及病毒病传播和扩散的机会。香蕉、胡椒、西番莲、黄灯笼辣椒等热带作物都遇到由CMV引起的病毒病危害，开展热带作物CMV病毒株系及其进化研究，对于掌握病害发生规律和科学防治具有重要作用。 香蕉种植业是海南支柱产业，CMV引起的香蕉花叶病是生产中的重要问题之一。作者从海口、儋州、东方等地市县采集了47个香蕉样品，进行了酶联免疫吸附(ELISA)血清学和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分子鉴定，结果14个样品呈CMV阳性。将14个阳性样品的CMV分离物外壳蛋白(CP)基因进行克隆测序，结果表明，所获得的CMV香蕉分离物与CMV亚组Ⅰ和亚组Ⅱ的CP基因核苷酸序列同源性分别为91.32％～99.54％和76.06％～77.73％，推导氨基酸序列同源性分别为94.04％～100％和80.37％～83.11％。 胡椒是重要的热带香辛作物，近年来胡椒花叶病有加重趋势。作者从海南儋州采集胡椒罹病植株，进行了ID-ELISA和巢式RT-PCR(NestedRT-PCR)检测。血清学和CP基因序列分析表明，CMV胡椒分离物(CMV-China)属亚组Ⅰ成员。该分离物与印度CMV胡椒分离物(CMV-India)CP基因同源性不高，核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为92.54％和98.17％，属于两个不同的株系。胡椒花叶病CMV病原的鉴定和分子检测研究国内尚属首次报道。 落葵是一种攀缘草本的食用蔬菜。作者从海口采集了表现花叶症状的落葵病样，通过ID-ELISA和巢式RT-PCR检测，发现病样中存在CMV。将得到的分离物CMV-BaCP基因进行测序并绘制系统进化树，结果表明，其与CMV-Rauvolfia的亲缘关系最近，它们共具一个祖节点，核苷酸同源性最高，达到95.43％，推导氨基酸同源性达到97.25％。本研究首次对落葵花叶病的病原进行了报道，确定落葵为CMV的新寄主。 本研究建立了CMV的ELISA血清学和RT-PCR分子检测方法。对海南香蕉上14个CMV分离物进行了ELISA血清学检测和CP基因序列分析；首次对海南胡椒和落葵CMV分离物进行了ID-ELISA血清学和分子鉴定。本研究为进一步开展热带地区CMV分子进化研究和由CMV引起的热作病害诊断防治奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1黄瓜花叶病毒及其病害的研究

1.1.1症状与寄主

1.1.2传播方式

1.1.3基因组成分

1.1.4株系或分离物

1.1.5变异研究

1.1.6病害防治

1.2植物病毒病的检测和鉴定方法

1.2.1生物学测定

1.2.2电镜观察

1.2.3 血清学检测

1.2.4分子生物学

1.3本研究的立题依据

1.3.1目的及意义

1.3.2主要研究内容

1.3.3研究技术路线

2材料与方法

2.1材料

2.1.1香蕉材料

2.1.2胡椒材料

2.1.3落葵材料

2.2载体与菌株

2.3试剂

2.4方法

2.4.1 ELISA检测

2.4.2植物总RNA的提取

2.4.3引物的合成

2.4.4单链cDNA的合成

2.4.5 PCR体外扩增

2.4.6 PCR产物的回收

2.4.7连接反应

2.4.8大肠杆菌感受态细胞的制备

2.4.9连接产物的转化

2.4.10菌落PCR筛选鉴定阳性克隆

2.4.11 CP基因的序列测定与序列的分析

3结果与分析

3.1 CMV香蕉分离物的血清学检测及CP基因序列分析

3.1.1 ELISA血清学检测

3.1.2 PCR体外扩增

3.1.3 14个阳性样品CP基因的序列测定及分析

3.1.4与部分CMV株系或分离物的CP基因序列同源性分析

3.2胡椒花叶病病原CMV的血清学鉴定及分子推测

3.2.1 ID-ELISA血清学检测

3.2.2巢式RT-PCR检测

3.2.3 CP基因的克隆和测序

3.2.4与部分CMV株系或分离物CP基因序列的同源性比较

3.3 CMV落葵分离物的血清学检测及分子诊断

3.3.1 ID-ELISA血清学检测

3.3.2 CP基因的克隆和测序

3.3.3与部分CMV株系或分离物CP基因序列的同源性比较

4讨论

4.1海南作物上CMV的研究

4.2关于国内CMV香蕉分离物的研究

4.3关于胡椒花叶病病原的研究

4.4关于落葵病害的研究

4.5 CMV株系鉴定和序列分析比较

4.5.1 14个CMV香蕉分离物的序列分析

4.5.2 16个CMV分离物的序列分析

4.6进一步研究设想

5结论

参考文献

致谢

附录