七种双壳贝类染色体核型及荧光原位杂交研究

摘要

本研究应用核型分析技术和荧光原位杂交(flourescence in situ hybridization，FISH)技术，对四种珍珠贝及三种牡蛎染色体进行了染色体核型分析及FISH分析。主要结果如下：
　　 1、以牡蛎鳃细胞为材料，采用PHA处理法、低温同步化法及活体去壳法进行预处理，制作成体染色体标本；以马氏珠母贝担轮幼虫为材料，采用PHA促繁殖获取胚胎法，制作胚胎染色体标本。对不同时间不同处理方式获得牡蛎染色体分裂相比例、PHA促繁殖获取胚胎法获得马氏珠母贝染色体分裂相比例进行统计。结果发现，PHA处理法在24h时能获取最多分裂相(3.5‰)，低温同步化法在72h时能获得最多分裂相(2.2‰)，活体去壳法始终保持较高分裂相比例(3.6‰)，PHA促繁殖获取胚胎法获得最大分裂相比例(10‰)。四种方法都能获得理想的中期分裂相数目。其中，低温同步化法缺点是温度难控制、预处理时间长；活体去壳法易导致贝类死亡；PHA促受精获取胚胎法缺点是胚胎的获取受繁殖季节限制。PHA处理法预处理时间短、获取分裂相数目多，无疑是贝类成体染色体制备的最好方法。同时，PHA也为贝类人工繁殖提供了一种更为有效的手段。
　　 2、分析了四种珍珠贝及三种牡蛎染色体核型。结果发现，四种珍珠贝染色体众数均为28。马氏珠母贝(Pinctada martensii)核型公式为2n=14m+12sm/st+2t，NF=54；黑珠母贝(P. nigra)核型公式为2n=4m+4sm+20t，NF=36；斑珠母贝(P. macula)核型公式为2n=28t，NF=28；企鹅珍珠贝(Pteria penguin)核型公式为2n=4m+24t，NF=32。鉴于四种珍珠贝染色体组型的相似性，可以认为他们的亲缘关系比较接近，如果进行种间杂交，杂交成功和产生杂交后代的可能性非常大。三种牡蛎染色体众数均为20。齿牡蛎(Dendistrea.folium)核型公式为2n=10m+10sm，NF=40；牡蛎(Crassostrea sp.)核型公式为2n=20m，NF=40；咬齿牡蛎(Saccostrea mordax)核型公式为2n=20m，NF=40。差异主要出现在对中部、亚中部着丝粒染色体；端部、亚端部着丝粒染色体这些形态比较类似的染色体的判断上。造成这种差异可能存在如下原因：1、实验方法不同，秋水仙素处理的时间不同，导致染色体伸展程度的差异；2、实验材料不同，有的以鳃组织为材料，有的以早期胚胎等为材料；3、所取材料属于不同的地理种群；4、在后期分析过程中，人为判断染色体着丝点位置的主观影响，均可能造成染色体分类的差异。
　　 3、研究了重复序列在七种双壳贝类染色体上的定位。采用顺序荧光原位杂交技术，对同一个染色体标本进行标记。结果发现，脊椎动物端粒序列(TTAGGG)10在七种双壳贝类的每一条染色体臂的端部区域都检测到较强黄绿色荧光信号。在染色体中部未被检测到，推测近期并未发生染色体重排或末端融合。
　　 18S-28S rDNA在马氏珠母贝染色体上检测到两簇荧光信号，位于第8号染色体短臂近端粒区域；在黑珠母贝染色体上检测到两簇荧光信号，位于第3号染色体短臂近端粒区域：在斑珠母贝染色体上检测到两簇荧光信号，位于第3号染色体臂的近端粒区域；在企鹅珍珠贝染色体上检测到四簇荧光信号，分别位于第1号染色体及第9号染色体臂的近端粒区域。在齿牡蛎染色体上检测到两簇荧光信号，位于第3号染色体臂的近端粒区域；在牡蛎染色体上检测到两簇荧光信号，位于第3号染色体臂的近端粒区域；在咬齿牡蛎染色体上检测到两簇荧光信号，位于第3号染色体臂的近端粒区域。推测仅具有-个18S-28S rDNA位点的珠母贝属的马氏珠母贝、黑珠母贝及斑珠母贝较具有两个位点的珍珠贝属的企鹅珍珠贝可能具有更古老的进化地位。
　　 5S rDNA在七种贝中均检测到两簇荧光信号。在马氏珠母贝中，位于第10号染色体长臂中间区域；在黑珠母贝中，位于第4号染色体长臂中间区域；在斑珠母贝中，位于第4号染色体臂的中间区域；在企鹅珍珠贝中，位于第1号染色体臂的中间区域。在齿牡蛎中，位于第2号染色体臂的中间区域；在牡蛎染色体中，位于第2号染色体臂的中间区域；在咬齿牡蛎中，位于第2号染色体臂的中间区域。两种不同的rDNA(18S-28SrDNA和5S rDNA)在珍珠贝和牡蛎中，均分布在不同的染色体上。虽然单纯考虑5SrDNA位点不足以提供染色体进化的依据，但结合rDNA(18S-28S rDNA和5S rDNA)及端粒序列，可初步将几对染色体区分开来。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

0 引言

1 双壳贝类染色体研究背景及现状

2 双壳贝类染色体核型分析

3 双壳贝类染色体带型分析

4 荧光原位杂交技术在双壳贝类细胞遗传学研究中的应用

4.1 荧光原位杂交技术的原理

4.2 荧光原位杂交技术在双壳贝类中的应用

5 双壳贝类染色体研究存在的问题及前景展望

5.1 贝类分类的准确性

5.2 染色体制片方法需要改进

5.3 荧光原位杂交特异性探针缺乏

6 本研究的目的和意义

第二章 双壳贝类染色体标本制备技术的优化

0 引言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 试剂的配置

1.5 成体染色体制片

1.6 胚胎制片

2 结果与分析

2.1 三种成体制片法效果比较

2.2 采用不同组织材料制片获取中期分裂相的比较

3 讨论

第三章 四种珍珠贝及三种牡蛎核型分析

O引言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 试剂的配置

1.5 染色体标本的制备

2 结果与分析

3 讨论

第四章 重复序列在四种珍珠贝及三种牡蛎染色体上的定位

0 引言

第一节 探针的制备

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 重复序列在染色体上的定位

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

项目资助

在读期间科研成果简介

致 谢