柱花草MSRA基因抗炭疽病功能的研究

摘要

柱花草(Stylosanthesspp.)是一种优良的热带豆科牧草，对于中南美洲、亚洲和非洲来说有重要的商业价值，然而，柱花草炭疽病的发生和流行限制了柱花草的进一步利用。Mineirao柱花草是一种高度抗炭疽病的品种，已在巴西得到了大面积的推广种植，但其抗病机理尚不清楚。 我们已经对Mineirao柱花草的抗病机理进行了初步研究，并用AFLP分子标记技术从其基因组DNA中获得了一特异片断SG2950-1，利用快速扩增cDNA末端(RACE)技术将基因组DNA特异片段的两端从Mineirao柱花草扩增出来，经测序后拼接得到MSRA基因的全长序列。 本研究将MSRA基因和植物表达载体通基因工程的方法构建了植物表达载体pCAMBIA2301-MSRA，通过冻融法将该植物表达载体导入根癌农杆菌LBA4404：以CIAT2312柱花草种子无菌萌发的幼苗为外植体，通过优化该柱花草再生体系，建立了CIAT2312柱花草遗传转化体系；将含pCAMBIA2301-MSRA的土壤农杆菌LBA4404.转化CIAT2312柱花愈伤组织，通过卡那霉素筛选获得阳性植株，阳性植株通过GUS染色和PCR鉴定证明MSRA基因已成功转入CIAT2312柱花草中。对转基因植株和非转基因植株接种炭疽菌CIATS100，结果转基因植株对炭疽菌表现出抗病性，而非转基因植株对炭疽菌高度感病，证明了MSRA基因是柱花草抗炭疽病相关的一种抗病基因。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 前言

1.1柱花草的重要性

1.2柱花草炭疽病

1.2.1柱花草炭疽病危害与分布

1.2.2柱花草炭疽病原菌的遗传多态性及流行性研究

1.3柱花草抗炭疽病育种研究进展

1.3.1收集柱花草种质资源培育抗病品种

1.3.2引种选育

1.3.3辐射育种

1.3.4杂交育种

1.3.5转基因抗病育种

1.4柱花草炭疽病抗病防控技术研究进展

1.5生物技术在柱花草上的应用

1.5.1柱花草组织培养研究进展

1.5.2柱花草转基因研究进展

1.5.3柱花草分子标记辅助育种研究

1.5.4柱花草基因克隆

1.6植物转基因研究进展

1.6.1植物转基因技术和方法研究进展

1.6.2转基因沉默原因及其解决转基因沉默的对策

1.7柱花草抗炭疽病研究存在的问题

1.8本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌种和质粒

2.2主要试剂及仪器设备

2.2.1生化试剂

2.2.2引物

2.2.3主要试剂配置

2.2.4.主要仪器和设备

2.3中间载体pGM-MSRA的构建

2.3.1 MSRA基因的扩增

2.3.2扩增产物的回收

2.3.3回收产物与T载体的连接

2.3.4宿主菌Ecoil TOP10感受态细胞的制备

2.3.5连接产物转化E.coil TOP10感受态细胞

2.3.6重组质粒的菌落PCR和酶切鉴定

2.3.7目的片段的回收

2.3.8测序及序列分析

2.4植物表达载体大片段的准备

2.4.1 pCAMBIA2301-HbCBF1质粒小量提取及酶切鉴定

2.4.2植物表达载体pCAMBIA2301-HbCBF1的质粒的大量提取

2.4.3植物表达载体pCAMBIA2301-HbCBF1质粒酶切及回收

2.5 pCAMBIA2301-MSRA植物载体构建

2.5.1MSRA基因与植物表达载体大片段的连接及连接产物的转化

2.5.2转化子的PCR和酶切鉴定

2.6植物表达载体pCAMBIA2301-MSRA转化农杆菌

2.6.1农杆菌LBA4404感受态的制备

2.6.2 pCAMBIA2301-MSRA质粒转化农杆菌LBA4404

2.6.3转化子的菌落PCR鉴定

2.6.4农杆菌质粒提取及酶切鉴定

2.7 CIAT2312柱花草组织培养

2.7.1无菌苗培养

2.7.2愈伤组织诱导

2.7.3不定芽的诱导

2.7.4诱导生根

2.7.5炼苗及移栽

2.8转基因研究

2.8.1材料对卡那霉素的敏感性试验

2.8.2材料预培养

2.8.3菌液的准备

2.8.4农杆菌侵染与共培养

2.8.5选择培养

2.8.6抗性芽的继代增殖

2.8.7抗性植株的生根培养

2.9转基因检测

2.9.1转化植株的GUS组织化学染色定位

2.9.2转化植株的基因组DNA提取

2.9.3 PCR险测

2.10转基因植株对炭疽病病原菌的反应

3 结果与分析

3.1 pCAMBIA2301-MSRA植物载体构建

3.1.1中间载体pGM-MSRA的构建

3.1.2 pCAMBIA2301载体的构建

3.2 pCAMBIA2301-MSRA质粒转化农杆菌LBA4404

3.3组织培养及农杆菌介导法转基因

3.3.1材料对卡那霉素的敏感性试验

3.3.2愈伤组织诱导

3.3.3不定芽的诱导

3.3.4诱导生根

3.4转基因检测

3.4.1转基因植株的GUS组织化学染色定位

3.4.2转化植株的DNA提取

3.4.3 PCR检测

3.5转基因植株对炭疽病病原菌的反应

4 讨论

4.1 MSRA基因在柱花草抗炭疽病的作用

4.2转基因载体构建方法及技巧

4.3激素对柱花草愈伤组织诱导的影响

5 结论

参考文献

附录

致谢