高蛋白酶活性地衣芽孢杆菌热带种筛选及水质净化效果研究

摘要

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)能够将水体中有机物分解为小分子的有机酸和氨基酸等物质,是水产养殖系统中最有效的水质净化菌种之一。本文从热带海水养殖环境中分离、筛选和鉴定了11株高蛋白酶活性地衣芽孢杆菌,研究了4个主要水质环境因子对部分目标菌株产酶活性及部分菌株对水质改良效果,具体结果如下:
　　 1.从海南文昌和海口的海水养殖池以及天然海区采集海水与底泥样品,并以目前海南水产养殖中2种常用的有益微生物制剂作为分离对照菌株的样品,采用高温(50℃)高盐(70g/L)的芽孢杆菌选择性培养基初步分离了326株芽孢杆菌,经脱脂牛奶平板法筛选获得了11株高蛋白酶活性的菌株,这些菌株的蛋白酶活性均极显著高于10μg/ml的蛋白酶K的活性(P＜0.01),并且,蛋白酶活性最高的菌株Pb-WC09005的蛋白酶活性也极显著高于从市售有益微生物制剂产品中分离的2株菌株。经菌落形态测定、标准生理生化分析和16S rDNA测序,确定获得的11株芽孢杆菌均为野生型热带种地衣芽孢杆菌。
　　 2.采用脱脂牛奶平板法研究了不同的盐度、温度、pH值、增氧剂(代表溶氧量)对地衣芽孢杆菌产酶活性的影响。①在pH7.5、温度为30℃时,除Pb-SP09003在盐度为10‰时的酶活性略大于盐度为0‰时外,其余菌株均为盐度为0‰时的酶活性最高,并随着盐度的增加其酶活性逐渐减弱;当盐度为50‰时,菌株Pb-HK09002、Pb-SP09001和Pb-SP09003已没有酶活性,而其余10个菌株还有较弱的酶活性,其水解圈直径仅为6.12～7.64 mm。②在pH7.5、盐度为30‰时,测定了18～38℃时温度对13株目标菌株的蛋白酶活力的影响,结果如下:Pb-WC09001、Pb-WC09002、Pb-WC09003、Pb-WC09004、Pb-WC09005、Pb-WC09006、Pb-WC09008、Pb-WC09009、Pb-WC09011、Pb-HK09001、Pb-FIK09002、Pb-SP09001、Pb-SP09003的蛋白酶活力的最适温度依次为34℃、34℃、38℃、38℃、34℃、34℃、38℃、38℃、38℃、38℃、38℃、34℃、34℃。③在温度为30℃、盐度30‰时,在pH6.0～9.0内,Pb-SP09001、Pb-SP09003、Pb-WC09005、Pb-WC09004、Pb-HK09002、Pb-HK09001、Pb-WC09002、Pb-WC09001的酶活性最高时的pH值依次为:6.0,6.0,7.5,8.5,6.0,7.5,7.5,8.0;Pb-HK09001在pH6.0时没有酶活性,Pb-WC09002在pH9.0时没有酶活性。④在pH7.5、温度为30℃、盐度为30‰时,增氧剂浓度为0‰～5‰(以1‰为梯度差)的条件下,Pb-WC09002在增氧剂浓度为1‰时,蛋白酶活性最强,为15.34 mm;Pb-WC09003在增氧剂浓度为2‰时,蛋白酶活性最强,为15.64 mm;Pb-WC09001在增氧剂浓度为2‰时,蛋白酶活性最强,为14.42mm;Pb-HK09001在增氧剂浓度为2‰时,蛋白酶活性最强,为13.88mm:Pb-SP09001在增氧剂浓度为3‰时,蛋白酶活性最强为15.54mm;Pb-SP09003在增氧剂浓度为3‰时,蛋白酶活性最强为14.54 mm。
　　 3.目标菌株在海水中的存活时间及其对牛血清白蛋白与COD的降解试验结果如下:①在室温条件下,8h时,除Pb-WC09004的数量基本不变外,其余菌株数量都明显增多;16h时,这些菌株数量几乎保持稳定,个别菌株甚至上升趋势;24h时,Pb-HK09002、Pb-WC09005、Pb-WC09003的数量还保持稳定,其余菌株数量明显呈下降趋势;3～5d,大部分菌株数量大幅度下降,但Pb-HK09002和Pb-WC09003的活菌数量还保持较高水平,表明这两个菌株的存活时间相对较长;5～6d以后,所有这些菌株数量下降到最低水平,所有菌株的数量基本保持稳定不变。②30℃培养0～72h后,加入Pb-SP09001、Pb-SP09003、Pb-HK09001、Pb-HK09002、Pb-WC09005、Pb-WC09001和Pb-WC09009的试验组水体中牛血清白蛋白含量均极显著低于对照组(P＜0.01),加入Pb-WC09002的试验组水体中牛血清白蛋白含量也明显低于对照组(P＜0.05)。③在30℃的条件下,12h时,养殖废水COD去除率最大为Pb-WC09002B,达57.45％;24h时,养殖废水COD去除率最大为Pb-WC09002B,达70.01％;36h时,养殖废水COD去除率最大为Pb-WC09005B,达79.30％;48h时,养殖废水COD去除率最大为Pb-WC09005B,达77.32％;72h时,养殖废水COD去除率最大为Pb-WC09005B,达86.09％;96h时,养殖废水COD去除率最大为Pb-WC09005B,达87.09％,以上这些野生型菌株对养殖废水COD的最大去除率均极显著高于对照组菌株Pb-SP09001A和Pb-SP09001B(P＜0.01)。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 芽孢杆菌的分类

2 地衣芽孢杆菌的应用研究

2.1 在水产养殖中的应用

2.2 在种植业方面的应用

2.3 在工业方面的应用

2.4 在医疗卫生方面的应用

2.5 在微生物酶学方面的研究

2.6 在基因工程研究方面的应用

3 本研究目的和意义

第二章 高蛋白酶活性地衣芽孢杆菌热带菌种的筛选与鉴定

1 材料与方法

1.1 样品

1.2 培养基

1.3 试剂

1.4 仪器

1.5 方法

2 结果与分析

2.1 菌种分离

2.2 高蛋白酶活性菌株筛选

2.3 菌种鉴定

3 讨论

第三章 水质环境因子对菌株产蛋白酶活力的影响

1 材料与方法

1.1 菌株

1.2 培养基

1.3 试剂

1.4 仪器

1.5 方法

2 结果与分析

2.1 盐度对目标菌株产酶活性的影响

2.2 温度对菌株产酶活性的影响

2.3 pH值对菌株产蛋白酶活力的影响

2.4 增氧剂对菌株产蛋白酶活力的影响

3 讨论

第四章 地衣芽孢杆菌对水质改良效果的研究

1 材料与方法

1.1 菌株

1.2 培养基

1.3 试剂

1.4 主要仪器和设备

1.5 培养方法

1.6 菌株存活时间测定

1.7 考马斯亮兰法测目标菌株对牛血清白蛋白(标准蛋白质)的降解效果

1.8 水质(COD)测定

2 结果与分析

2.1 菌体存活时间

2.2 目标菌株对牛血清白蛋白的降解效果

2.3 水质(COD)测定结果

3 讨论

参考文献

在学期间发表或撰写的学术论文

致谢