耐寒相关基因转化华南木薯品种研究

摘要

木薯(Manihot esculenta Crantz)是世界热带亚热带地区重要的粮食与经济作物之一。传统的育种方式为选育木薯良种方面作出了重要的贡献,但是由于木薯是高度杂合的特质加上种质资源的限制及常规育种方法的局限性,让木薯进一步的遗传改良陷入困境。随着分子生物学研究的深入,基因的鉴定、克隆、重组技术及转基因技术的日趋成熟,利用基因工程手段进行木薯遗传改良,增强木薯抗病虫和耐逆境能力,提高木薯块根产量,改善木薯淀粉品质及降低有害物质的含量等,已成为木薯育种的一种有效手段。木薯是一种抗逆性比较强的热带、亚热带作物,但是地域性的适应特性决定其不能忍受低温的环境。通过农杆菌法将抵抗逆境相关的基因引入木薯基因组,可以改善木薯的耐寒品质,使其能在较低温度的环境中种植,为木薯北移或特异性区域种植提供品种保障。
　　 本研究以四个木薯优良品种华南5号、6号、7号和8号为实验材料,进行了以下方面的研究:建立了木薯无菌苗繁殖系统;木薯体胚的循环诱导及体胚子叶再生培养条件研究;消毒剂种类、取材时间及取材地点对木薯外植体消毒效果的影响;6-BA对木薯单芽茎段生长的影响;2,4-D和picloram对不同品种木薯体胚发生能力的影响;体胚成熟时间对子叶植株再生能力的影响;建立了木薯遗传转化受体体系;利用建立的木薯遗传转化受体系统,采用农杆菌(GV3101)介导对木薯体胚子叶进行遗传转化,并对共培养时间对遗传转化的影响进行研究;用六个植物表达载体对华南木薯优良品种华南5号、6号和8号进行转化,并获得再生植株共1279株;对再生植株进行抗性检测及分子检测;将转基因植株炼苗移栽至花盆,成功移栽了600多株苗;对转基因株系进行组培苗和盆栽苗的低温处理鉴定其低温胁迫下的适应能力。主要研究结果如下:
　　 1.取材时间地点及消毒剂对木薯启动培养消毒影响效果不同,研究表明最佳的消毒方式是:取室内培养的木薯外植体材料,经过洗衣粉水浸泡10min,流水冲洗20min,75％酒精浸泡40s,0.1％HgCl2消毒10min,可达到很好的消毒效果,无菌率在90％以上。
　　 2.6-BA对抑制木薯顶端优势很明显,浓度越高抑制越强。它不仅抑制木薯芽的径向生长,也抑制根的径向生长。但是适宜的浓度可以促使木薯腋芽萌发产生丛生芽。对于需要木薯植株快速成苗的情况,以不添加任何激素的MS基本培养基培养效果最好。
　　 3.两种激素2,4-D(8mg/l)和picloram(12mg/l)对四个木薯初级体胚的形成都有很强的促进作用,其效果相当。初级体胚继代后除华南7号木薯外都能达到100％的产胚率,而华南7号得木薯初级体胚却在继代后衰败。
　　 4.CaCl2在木薯初级体胚的诱导过程中作用不明显,而继代后30d就有了明显的结果,实验设计范围内的高浓度CaCl2对继代后的体胚形成有促进作用。15mmol/l的CaCl2可以保持体胚100d的活力。
　　 5.成熟培养不同时间对木薯体胚子叶器官发生很有影响。成熟10～15d的木薯体胚子叶器官发生率比较好,诱导频率在70％以上。
　　 6.华南木薯良好的遗传转化体系:将培养10～15d的子叶胚尽量切小,用OD600在0.9～1.1之间的工程菌液进行侵染45min,然后共培养3d后清洗去菌,转到含500 mg/l羧苄青霉素和10mg/l潮霉素的低选择压器官发生培养基上进行初筛及高抗菌素脱菌1周后,再进行500mg/l羧苄青霉素和20mg/l潮霉素正常选择压器官发生培养基筛选2～3周。经过两次筛选的组织已有器官发生,选择有芽器官的组织转到茎器官伸长培养基上培养直到芽长至1～2cm。切下芽接种到无激素培养基上成苗培养。适量扩繁转化苗后,切取1～2cm顶端部分茎段进行10mg/l潮霉素选择压生根筛选。对于选择压下有根形成的转化株系再进行后续的分子检测。该体系适合华南5号,6号,8号;但转化效率略有差别。以华南8号得转化效率最好,华南5号和华南6号效果相当。
　　 7.通过PCR检测的方法对筛选压上形成的转化植株进行了检测,共鉴定出:pVKH-35S-AtGolS2-pA转基因木薯198个PCR阳性株系,其中PCR为阳性且在筛选压上生根的株系有81个。pVKH-35S-AtGolS2-ipt-pA转基因木薯203个阳性株系,其中PCR为阳性且在筛选压上生根的株系有79个。pVKH-35S-CBF3-pA转基因木薯167个阳性株系,其中PCR为阳性且在筛选压上生根的株系有50个。pCA-CP-CBF3-pA转基因木薯123个阳性株系,其中PCR为阳性且在筛选压上生根的株系有78个。pVKH-35S-AtGolS3-pA转基因木薯309个阳性株系,其中PCR为阳性且在筛选压上生根的株系有93个。pCA-CP-CBF3-35S-AtGolS3-pA转基因木薯104个阳性株系,其中PCR为阳性且在筛选压上生根的株系有25个。
　　 8.通过RT-PCR对PCR为阳性且筛选压上可以生根的株系进行对应的检测。结果得到pVKH-35S-AtGolS2-pA转基因木薯65个阳性株系;pVKH-35S-AtGolS2-ipt-pA转基因阳性株系48个;pVKH-35S-CBF3-pA转基因阳性株系39个;pCA-CP-CBF3-pA转基因57个阳性株系;pVKH-35S-AtGolS3-pA转基因木薯64个阳性株系;pCA-CP-CBF3-35S-AtGolS3-pA转基因木薯20个阳性株系。
　　 9.对部分RT-PCR结果为阳性的植株进行了PCR-southern杂交结果也为阳性。这一系列的检测进一步证明了抗寒基因在实验的3个华南木薯品种中得以整合并表达。转基因植株的基因组酶切Southern杂交正在探索中。
　　 10.本文通过对木薯组培苗移栽基质的选择、移栽季节的选择及苗的状态方面的研究,表明适合木薯移栽的经济方法是:采用海南红土+细沙(+腐殖土)=2:2(:1)作为栽培基质,选择在每年的2～3月份,将培养1月的组培苗进行水培闭口3d,开口4d炼苗后,移栽,移栽后浇足定根水。通过此法,本研究成功移栽600多株木薯转基因苗。本研究还发现,对越冬木薯组培移栽苗进行春季修剪,留下基本10cm左右主茎,可以促进木薯苗的快速生长。
　　 11.本研究对转基因木薯组培苗及盆栽苗进行了低温处理检测。通过对转基因木薯组培苗和非转基因组培苗进行低温胁迫观察表型变化,发现在相同的处理条件下,非转基因植株因不能适应低温的环境,完全枯死,而部分木薯转AtGolS2、AtGolS2-ipt、CBF3基因株系却表现出了很强的低温耐受性,植株项部生长组织并没有被低温完全迫害,恢复室温后又能继续生长。通过对盆栽苗进行4℃低温处理及生理指标的检测发现,部分转AtGolS2、AtGolS2-ipt、CBF3等基因的木薯株系,SOD活性在低温胁迫后增幅非常大,甚至有的超过常温时的3倍,与之相对应的MDA含量比常温下的含量还要低。进一步证明了,基因的转化对改良木薯耐寒品质具有一定的效果。田间耐低温试验将是下一步必须的检测工作。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩写词表(Abbreviations)

1 绪论

1.1 木薯生物学特性

1.2 我国木薯种植区域分布

1.3 转基因技术在木薯上的应用

1.3.1 抗病毒

1.3.2 抗虫

1.3.3 降低生氰化合物含量

1.3.4 提高蛋白质含量

1.3.5 抗除草剂

1.3.6 控制淀粉含量及组成

1.4 木薯转基因潜力

1.4.1 木薯抗逆境能力

1.4.2 木薯采后衰变

1.5 植物耐寒遗传改良研究进展

1.5.1 与膜稳定性相关的抗寒分子育种

1.5.2 抗氧化酶活性相关的抗寒分子育种

1.5.3 与抗冻蛋白表达相关的抗寒分子育种

1.5.4 与低温信号转录相关的抗寒分子育种

1.5.5 与渗透调节相关的抗寒分子育种

1.5.6 与植物激素调节相关的抗寒分子育种

1.6 耐寒转基因木薯研究的目的意义及研究背景

1.7 本研究的主要内容与技术路线

1.7.1 研究所用的基因简介

1.7.2 实验所用的表达载体简介(山我们实验室构建)

1.7.3 主要内容

1.7.4 研究的技术路线

2 木薯遗传转化受体系统的建立

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 生化试剂

2.1.3 主要仪器和设备

2.1.4 培养基及添加成分

2.2 实验方法

2.2.1 木薯无菌苗体系的建立

2.2.2 木薯无菌苗的继代增殖

2.2.3 木薯体胚的诱导及循环培养

2.2.4 CaCl2对木薯体胚的影响

2.2.5 木薯体胚子叶的成熟及再生培养

2.3 结果分析

2.3.1 木薯外植体消毒方法的确定

2.3.2 不同浓度6-BA对木薯单芽茎段培养的影响

2.3.3 不同激素对木薯体胚诱导的影响

2.3.4 不同CaCl2浓度对木薯体胚的影响

2.3.5 培养时间对木薯成熟胚子叶再生能力的影响

2.3.6 木薯体胚循环发生及植株再生途径

2.4 结论与讨论

2.4.1 木薯高效再生体系的建立

2.4.2 木薯无菌苗的继代及扩繁

2.4.3 木薯体胚的发生

2.4.4 CaCl2对长期保持体胚活力的影响

2.4.5 木薯植株再生

小结

3 表达载体的验证及木薯的遗传转化

3.1 实验材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 根癌农杆菌菌株及载体

3.1.3 试剂的配制

3.1.4 主要仪器和设备

3.1.5 培养基添加成分

3.2 实验方法

3.2.1 根癌农杆菌的活化及工程菌液的制备

3.2.2 农杆菌质粒的提取(碱裂解法)

3.2.3 大肠杆菌的活化及感受态制备

3.2.4 农杆菌质粒转化大肠杆菌感受态

3.2.5 大肠杆菌质粒提取及酶切鉴定

3.2.6 农杆菌转化体胚子叶及筛选再生

3.3 结果与分析

3.3.1 植物表达载体转化大肠杆菌酶切鉴定

3.3.2 木薯转化及植株再生

3.3.3 共培养时间对木薯转化的影响

3.3.4 再生植株的生根筛选

3.4 结论与讨论

3.4.1 木薯遗传转化方法及影响转化率的因素

小结

4 木薯转基因植株的检测

4.1 实验材料

4.1.1 植物材料

4.1.2 试剂药品

4.1.3 转基因木薯的PCR引物设计

4.1.4 主要仪器设备

4.2 实验方法

4.2.1 质粒DNA的提取(碱法)

4.2.2 木薯基因组DNA的提取

4.2.3 木薯总RNA小量提取(Super RNAzol法)

4.2.4 PCR检测

4.2.5 RT-PCR检测

4.2.6 PCR-Southern杂交检测

4.3 结果与分析

4.3.1 木薯总DNA的提取

4.3.2 转pVKH-35S-AtGolS2-pA基因植株的PCR检测

4.3.3 转pVKH-35S-AtGolS2-ipt-pA基因植株的PCR检测

4.3.4 转pVKH-35S-CBF3-pA基因植株的PCR检测

4.3.5 转pCA-CP-CBF3-pA基因植株的PCR检测

4.3.6 转pVKH-35S-AtGolS3-pA基因植株的PCR检测

4.3.7 RT-PCR检测

4.3.8 PCR-Southern杂交检测

4.4 结论与讨论

4.4.1 木薯转基因植株的检测与鉴定

小结

5 木薯试管苗炼苗移栽

5.1 实验材料

5.1.1 植物材料

5.2 实验方法

5.2.1 基质的选择

5.2.2 瓶苗炼苗方式

5.2.3 移栽季节选择

5.2.4 组培苗状态

5.2.5 瓶苗移栽后的养护管理

5.3 结果与分析

5.3.1 不同基质对移栽苗成活的影响

5.3.2 炼苗方式对移栽成活的影响

5.3.3 不同移栽时期对移栽成活的影响

5.3.4 组培苗状态对移栽成活的影响

5.3.5 春季修剪对移栽苗生长状况的影响

5.4 结论与讨论

小结

6 转基因植株耐寒性分析

6.1 实验材料

6.1.1 植物材料

6.1.2 试剂配制

6.1.3 主要仪器设备

6.2 实验方法

6.2.1 低温处理试管苗

6.2.2 低温处理盆栽苗

6.2.3 酶液提取

6.2.4 低温处理木薯SOD活性的测定

6.2.5 丙二醛(MDA)的测定

6.3 结果与分析

6.3.1 低温处理后转基因木薯试管苗状况

6.3.2 木薯转pVKH-35S-AtGolS2-pA基因植株的耐寒性

6.3.3 木薯转pVKH-35S-AtGolS2-ipt-pA基因植株的耐寒性

6.3.4 木薯转pCACP-CBF3-pA基因植株的耐寒性

6.4 结论与讨论

6.4.1 转基因木薯抗寒性及其检测

6.4.2 AtGolS2和ipt的转录融合转化木薯

6.4.3 CBF3和AtGolS3转基因木薯

小结

7 结论与研究展望

7.1 结论

7.2 研究展望

参考文献

作者简历

致谢