橡胶树乳管细胞SCF复合物相关蛋白的基因克隆及表达分析

摘要

茉莉酸信号途径是由SCFCOI1泛素蛋白复合体,JAZ阻遏蛋白家族和MYC转录因子家族三个核心环节构成。SCFCOI1复合体由SCF骨架SKP1、Cdc53/cullin和Rbx1和F-Box蛋白COI1组成,并受到Cand1,RUB和CSN的调控。我们已证明茉莉酸能够诱导橡胶树次生乳管分化,调控天然橡胶生物合成,并克隆了HbCOI1,HbJAZ1和Hb1MYC1等基因。本研究为鉴定乳管细胞SCFCOI1泛素蛋白复合体各蛋白组分,同源克隆了胶乳HbCul1、HbSKP1和HbRBX1基因,并进行基因表达分析。构建了HbCul1、HbSKP1、HbRBX1、HbCOI1和HbJAZ1基因的原核表达载体,获得纯化蛋白。此外,还构建了PHbCOI1全长启动子酵母单杂交诱饵载体、三重复核心启动子酵母单杂交诱饵载体进行相互作用转录因子筛选,研究结果如下:
　　 1、构建胶乳EST文库,根据NCBI注册的Cul1,SKP1和RBX1基因,蛋白序列设计引物,通过RT-PCR和RACE技术克隆了橡胶树胶乳中的HbCul1,HbSKP1和HbRBX1全长Cdna。克隆的HbCul1的Cdna全长为2762bp,包含2235 bp的开放阅读框,153 bp的5'非编码区和374 bp的3'非编码区,编码一个由744个氨基酸组成的蛋白,该蛋白含有Cul1家族特征性的Cullin Superfamily和Cullin Nedd8结构域,理论分子量为87kD,等电点(Pi)为6.56。推导的氨基酸序列与拟南芥、北美云杉、蓖麻、毛果杨、烟草、葡萄的同源性分别达到82％、87％、97％、97％、82％和95％;克隆的HbSKP1的Cdna全长为778 bp,包含543 bp的开放阅读框,47 bp的5'非编码区和188bp的3'非编码区,编码一个由180个氨基酸组成的蛋白,该蛋白含有SKP1家族特征性的Skp1-POZ和Skp1结构域,理论分子量为20.3kD,等电点(Pi)为4.38。推导的氨基酸序列与毛果杨、蓖麻、拟南芥、甜椒、大豆、葡萄的同源性分别达到61％、64％、47％、48％、50％和48％;克隆的HbRBX1的Cdna全长为638 bp,包含351 bp的开放阅读框,32bp的5'非编码区和255的3'非编码区,编码一个由116个氨基酸组成的蛋白,该蛋白含有RBX家族特征性的RING Superfamily结构域,理论分子量为13kD,等电点(Pi)为6.2。推导的氨基酸序列与拟南芥、花生、西加云杉、大豆、毛果杨、葡萄的同源性分别达到92％、93％、92％、94％、90％和90％。
　　 2、荧光实时定量PCR分析表明,割胶、茉莉酸、乙烯利上调HbCul1表达,机械伤害对HbCul1表达影响不明显;割胶、机械伤害、乙烯利上调HbSKP1表达,荣莉酸对HbSKP1表达影响不明显;割胶、机械伤害、茉莉酸、乙烯利上调HbRBX1表达。
　　 3、构建了HbCul1、HbSKP1、HbRBX1、HbCOI1、HbJAZ1的原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了融合蛋白HbCul1-HiS(6)、HbSKP1-His(6)、HbCOI1-His(6)和HbJAZ1-HiS(6)。
　　 4、通过酵母单杂交系统,筛选出与HbCOIl全长启动子相互作用的WD-Repeat蛋白。由HbWDR1编码。其全长Cdna全长为4036bp,具备完整的长度为3387 bp阅读框,编码1128个氨基酸,5'非编码区长度为168 bp,3'非编码区长度为481 bp,理论分子量为123.85kD,等电点(Pi)为6.77,氨基酸序列含有一个LisH结构域、一个CTLH结构域和两个WD40结构域。其所推导蛋白的氨基酸序列分别与拟南芥、蓖麻、毛果杨、葡萄的同源性达到73％、89％、86％和85％。
　　 5、本研究为鉴定乳管细胞茉莉酸信号途径的关键成员和进一步研究茉莉酸信号途径的调控机制打下良好基础。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 茉莉酸生物合成及生理功能

1.2 茉莉酸信号途径分子机制的研究进展

1.2.1 SCFCOI1泛素蛋白复合体

1.2.2 JAZ阻遏蛋白家族研究进展

1.2.3 MYC转录因子家族研究进展

1.2.4 COI1-JAZ-MYC2是茉莉酸信号途径的核心组件

1.3 SCF复合物核心成份及形成调节

1.3.1 Cullin蛋白

1.3.2 RBX1蛋白(Ring-box 1)

1.3.3 SKP的结构和功能

1.3.4 Cand1对SCF组装的调节

1.3.5 CSN对SCF组装的调节

1.3.6 Nedd8/RUB对SCF组装的调节

1.4 茉莉酸信号途径与天然橡胶生产

1.4.1 茉莉酸调控乳管分化和天然橡胶生物合成

1.4.2 乳管细胞是研究茉莉酸信号的优良模型

1.4.3 橡胶树茉莉酸信号途径基因

1.5 本研究的目的和意义

1.6 本研究的技术路线

2.材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 材料

2.1.2 质粒及菌种

2.1.3 生化试剂

2.2 方法与步骤

2.2.1 胶乳RNA的提取

2.2.2 3'RACE扩增HbCul1,HbSKP1基因的3’端

2.2.3 5'RACE扩增HbCul1的5'端

2.2.4 HbCul1、HbSKP1,HbRBX1基因全长cDNA的PCR扩增

2.2.5 HbCul1、HbSKP1、HbRBX1的表达分析

2.2.6 HbCul1、HbSKP1、HbRBX1、HbCOI1和HbJAZ1基因的原核表达

2.2.7 HbCOI1基因转录因子的分离鉴定

3 结果与分析

3.1 胶乳RNA的提取

3.2 HbCul1、HbSKP1、HbRBX1基因的克隆

3.2.1 HbCul1、HbSKP1、HbRBX1基因EST片段的比对分析

3.2.2 HbCul1、HbSKP1 3'端序列的扩增

3.2.3 HbCul1 5'端序列的扩增

3.2.4 HbCul1、HbSKP1,HbRBX1基因全长cDNA的克隆

3.2.5 HbCul1、HbSKP1、HbRBX1所推导氨基酸序列的同源性分析

3.3 HbCul1、HbSKP1、HbRBX1基因的表达分析

3.3.1 割胶、机械伤害、外源茉莉酸、外源乙烯利对HbCul1表达的影响

3.3.2 割胶、机械伤害、外源茉莉酸、外源乙烯利对HbSKP1表达的影响

3.3.3 割胶、机械伤害、外源茉莉酸、外源乙烯利对HbRBX1表达的影响

3.3.4 外源茉莉酸对HbCOI1及外源乙烯利对几丁质酶基因表达的影响

3.4 HbCul1-His(6)、HbSKP1-His(6)、HbRBX1-His(6)、HbCOI1-His(6)、HbJAZ1-His(6)融合蛋白的原核表达

3.5 HbCOI1基因转录因子的分离

3.5.1 酵母单杂交诱饵载体的构建

3.5.2 pHIS2.1-PHBCOIL和pHIS2.1-3PHBCOIC在S.cerevisiae strain Y187中的本底表达

3.5.3 酵母单杂交文库的构建

3.3.4 酵母单杂交筛库结果

3.5.5 HbWDR1核酸序列及推导氨基酸序列的同源性分析

4 讨论

4.1 HbCul1、HbSKP1、HbRBX11和HbWDR1是Cul、SKP、RBX和WD-Repeat基因家族成员

4.2 割胶、机械伤害、激素对HbCul1、HbSKP1、HbRBX11基因表达的影响

4.3 关于原核表达HbCul1、HbSKP1、HbRBX1、HbCOI1、HbJAZ1和HbMYC1

4.4 关于启动子诱饵载体的构建和文库ds cDNA的构建

4.5 HbCOI1 HbWDR1的相互作用

5 结论

参考文献

附录一:有关试剂的配制

附录二:缩写词

附录三:HbMYC1原核表达产物的SDS-PAGE

致谢