青藏高原尼泊尔黄堇根际微生物群落结构研究

摘要

青藏高原地处亚洲中部,位居中国的西南部,有独特的高原性气候,它为生物学及相关学科的研究,提供了理想的实验材料。尼泊尔黄堇作为一种藏药材,近年来,随着青藏高原生态环境极度恶化及人类不断的开采与破坏,尼泊尔黄堇已经趋于濒临灭绝的状态。尼泊尔黄堇是青藏高原重要的植被之一,研究其根际土壤微生物的群落结构和功能多样性,对保护和人工种植尼泊尔黄堇具有重要的生态学意义,首次获得尼泊尔黄堇根际独特的微生物资源,并对鉴定及建立微生物资源库提供了理论数据。本研究选取了11个来自不同海拔、经纬度的根际土壤样品,通过Real time QPCR、Biolog技术及高通量测序,结合土壤理化性质的分析,对尼泊尔黄堇根际土壤微生物分布规律及多样性进行了研究,得出以下主要结论:
　　1.整个研究区域根际土壤pH属于中性,中部的pH普遍大于东西面,介于6.7-7.7之间,其中,最低 pH值出现在经度为82.18.828,为6.74,最高 pH值出现在经度为86.35.064,为7.68。从西到东,土壤C/N的值形成逐渐减小的趋势,土壤电导率也明显地减少。这些指标共同指征随着经度的推移,土壤由东到西趋于贫瘠化。
　　2.荧光定量 PCR研究结果表明:定量随着经度跨度,从西到东跨越15个经度的11个样点,西藏尼泊尔黄堇根际细菌的基因拷贝数的变化范围为9.64E+09~8.18E+08,依次呈减少的趋势。随着经度跨度,西藏尼泊尔黄堇根际古菌的基因拷贝数变化范围为:1.22E+05~2.89E+07,依次呈增加的趋势。西藏尼泊尔黄堇根际真菌的基因拷贝数变化范围为:2.44E+06~7.22E+04,依次呈减小的趋势;并且真菌的基因拷贝数与与地上生物量呈显著负相关。总体上形成细菌丰度>古菌丰度>真菌丰度的变化态势;并且微生物的总体基因拷贝数从西到东呈现减小的趋势。根际微生物的三个主要组成部分,细菌、古菌、真菌的基因拷贝数随着经度呈现出不同的趋势,除了环境因子的影响之外,也在一定程度上表明微生物群落形成的复杂性,存在着种内竞争或者互作的现象。
　　3. Biolog实验表明:青藏高原尼泊尔黄堇根际微生物不同群落利用六大类碳源:单糖/糖苷、氨基酸类、酯类、醇类、胺类、酸类的能力都不同,11个采样点的微生物群落的优势碳源都不同。在本研究中,土壤理化因子包括电导率和 TDS,土壤 C/N的比例,三者对于土壤根际微生物利用六大类碳源的能力,都呈现出显著正相关性,即都具有促进作用。经过对培养时间与微生物数量结果的分析,发现在培养时间在72h时,微生物的平均吸光值(AWCD)处于稳定状态,而经相关性分析得到与pH呈显著负相关,说明微生物多样性指数主要受到土壤pH的影响,而不是随地域差异而发生变化。土壤微生物群落多样性指数包括丰富度指数(Diversity H)和均匀度指数(Diversity U),经相关性分析得到Diversity U与TDS及C/N呈显著正相关,充分说明不同样点的微生物均匀度受土壤理化因子的影响。diversity U与土壤C/N具有显著正相关,说明当碳含量高,而氮含量低时,更促进根际微生物的代谢活性,也就更利于地上植物尼泊尔黄堇的生长。研究结果表明:尼泊尔黄堇根际微生物的多样性和基因丰度相比,更易受到土壤理化性质的影响,而非经度等地理跨度的影响。
　　4.高通量测序结果表明:香浓指数随着经度的不同,由西到东逐渐增大,而 Read Number、OUT、chao1、辛普森指数在样点5处达到了最高点,说明样点5中物种的丰富度达到了最高点。从西到东,随着经度的逐渐增大,酸杆菌门(Acidobacteria)的数目逐渐增大,拟杆菌门(Bacteroidetes)的数量逐渐减小;并且在样点1和样点2中酸杆菌门的数目明显低于拟杆菌门,而在样点3中酸杆菌门和拟杆菌门的数目发生了明显的改变,首次酸杆菌门的数目超越了拟杆菌门的数目,甚至在样点4中,也依然是酸杆菌门相对于拟杆菌门占有很大的优势,这种优势也存在于样点5和样点11中,因此在地理空间跨度很大的情况下,微生物群落菌门呈现出了相对显著的趋势,说明地理格局或不同的环境因子影响着微生物的数目及种类的多少,也许会存在种内竞争和种内互助的关系。研究结果表明,从整个采样点来看,西藏尼泊尔黄堇根际微生物群落中的优势菌门为酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)。

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1引言

1.1 土壤中的微生物

1.2 根际微生物的研究进展

1.3 微生物群落结构的影响因素

1.4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 研究区域概况

2.2 样品采集和土壤理化性质分析

2.3 biolog实验

2.4 定量PCR实验

2.5 高通量测序

2.6数据统计分析

3结果与分析

3.1 土壤理化性质

3.2 尼泊尔黄堇根际微生物数量特征

3.3 对11个样点微生物基因拷贝数的聚类分析

3.4 Biolog生态板对植物根际微生物群落分析

3.5 相关性分析

3.6 焦磷酸高通量测序

4 结论与展望

4.1 根际土壤理化性质

4.2 根际土壤微生物丰度

4.3 Biolog生态板对植物根际微生物群落分析

4.4 焦磷酸高通量测序

展望

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果