青藏高原不同海拔咸水湖微生物多样性及适应性特征

摘要

随着人们对环境问题的日益关注,青藏高原得天独厚的地理位置和物种资源使其成为生态学研究的热点。蓝细菌作为地球上最早出现的产氧光合原核生物,它在生物进化过程中的独特性以及生态结构中的重要性使其成为科学研究的模式生物。本研究以青藏高原不同海拔咸水湖作为研究对象,以咸水湖中的微生物作为研究材料,采用微生物分离、纯化和培养技术、传统的微生物分类技术及分子生物学方法,研究了青藏高原不同海拔咸水湖湖水中微生物多样性、蓝细菌的适应性特征及其与生态因子的相互关系。首次获得高海拔咸水湖独特的微生物资源,并对鉴定及建立微生物资源库提供了理论数据,得出以下主要研究结果:
　　1、研究中利用AB培养基富集三个不同海拔咸水湖纳木错湖、运城盐湖、青海湖中的蓝细菌,并且利用毛细管法和平板划线法相结合的方式分离纯化得到粘球藻属、棒条藻属、蓝纤维藻属、微囊藻属、颤藻属、色球藻属、鱼腥藻属、束球藻属共计11株蓝细菌菌株。
　　2、对分离得到的11株蓝细菌扩大培养,从中挑选生长旺盛的分别来自于青海湖和纳木错湖的NMC1和QH4两株蓝细菌作为研究材料,以运城盐湖分离得到的微囊藻YC1作为平行对照,对其进行UV-B为期12 d的辐射处理,研究长期增强UV-B胁迫对蓝细菌生长发育和生理代谢的影响及蓝细菌的适应性,结果如下:(1)UV-B胁迫下,NMC1、QH4、YC1的生物量和可溶性糖含量都表现出不同程度的下降趋势,但是高海拔的下降幅度远低于YC1,且变化趋势相似,QH4的可溶性糖含量甚至在最后一天超过了空白对照组;(2)UV-B胁迫下,不同于YC1,NMC1和QH4的叶绿素a、藻胆蛋白、伪枝藻素含量基本都随UV-B处理时间的延长出现了先下降后上升的趋势;(3)UV-B胁迫下,高海拔湖水蓝细菌NMC1和QH4的类黄酮含量表现出随着处理时间的延长先上升后下降的趋势,但是总量高于空白对照组也高于YC1,蓝细菌QH4的CAT酶活性随着处理时间的延长而上升,而YC1中类黄酮含量、SOD、CAT酶活比其空白对照组总体呈现出下降的趋势。验证了不同于低海拔蓝细菌,NMC1和QH4存在相似的对高辐照环境的响应机制和适应性特征,高海拔湖水中蓝细菌能够更好地抵御UV-B对细胞的损伤。
　　3、利用宏基因组测序对不同海拔湖水中微生物群落结构进行研究,分析了纳木错湖、运城盐湖、青海湖五个不同月份湖水中微生物多样性的季节性变化,分别对研究样本的16S rDNA V4区进行高通量测序并对研究数据进行了包括稀释曲线、多样性丰度分布曲线、维恩交集、Alpha多样性分析、单样品物种分布、多样品物种分布、RDA冗余在内的具体分析。
　　研究结果表明,青海湖和纳木错湖中优势菌群的种类和分布比例相似度较高,主要集中在拟杆菌门Bacteroidetes、变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、和疣微菌门Verrucomicrobia,并且两个湖同样在6-10月期间,浮霉菌门Planctomycetes的比例会突然上升,而运城盐湖中优势菌群的不同之处在于厚壁菌门Firmicutes的比例非常高;物种丰度排序Q10>Y6>Q8>N10>N6>Q6>Y10>Q4>N5>N8>Y8>Q5>Y4>Y5>N4;纳木错湖和青海湖中的微生物(属水平)分别与运城盐湖中微生物种类的相似度是10.9％和18.4%,而纳木错湖和青海湖的物种相似度达到了37.6%以上,且其中多数为耐寒菌种,三个湖共同拥有的菌种占到1217个属;结合环境因子的冗余分析可以看出,纳木错湖6月和8月的微生物多样性与光照强度呈显著正相关,与气温、水温密切相关的是运城盐湖6月和10月水样中微生物的多样性。

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1 绪论

1.1 湖泊微生物多样性

1.2 湖泊微生物多样性研究方法

1.2.1 可培养技术

1.2.2 16S rDNA文库技术及其应用

1.2.3 DGGE（变性梯度凝胶电泳）技术及其应用

1.2.4 宏基因组法及其结合环境因子的应用

1.3 蓝细菌及其基本适应特征

1.4 蓝细菌对极端环境因子的响应

1.4.1蓝细菌对UVR（紫外辐射）增强的响应

1.4.2蓝细菌对极端环境温度的响应

2 不同海拔咸水湖中蓝细菌的分离鉴定

2.1 研究材料与方法

2.1.1 研究材料

2.1.2 分离纯化方法

2.2 研究结果

3青藏高原不同海拔咸水湖中蓝细菌的适应特征

3.1 研究材料

3.2 研究方法

3.2.1 材料的处理

3.2.2 生理指标的测定方法

3.3 研究结果与讨论

3.3.1 长期UV-B辐射对蓝细菌生长的影响

3.3.3长期UV-B辐射对蓝细菌抗氧化系统的影响

4 青藏高原不同海拔咸水湖微生物多样性

4.1 Miseq宏基因组测序

4.1.1 研究材料

4.1.2 研究方法及步骤

4.1.3 结果与讨论

4.2 构建16S rDNA克隆文库

4.2.1 研究材料

4.2.2 16S rDNA克隆文库构建方法

4.2.3 16S rDNA克隆文库构建结果

4.3 Miseq宏基因组测序和16S rDNA克隆文库的比较分析

5. 结论

致谢

参考文献

附录A N4 16S rDNA系统发育树

攻读学位期间的研究成果