冻存对骨髓基质细胞生物学特性影响的实验研究

摘要

传统的牙周病治疗方法常因牙周局部缺少足量的内源性干细胞而疗效有限。骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)是组织工程技术重要的种子细胞，与支架材料、生长因子联合应用可以有效修复组织缺损。同一时期内要获得同一标准的大量BMSCs，需经过繁琐的培养过程，在一定程度上造成人力、物力、时间的浪费，所以有必要寻找一个方便、简洁、安全、有效的保存细胞生物学特性的方法。 目的：研究Beagle犬BMSCs体外连续培养的增殖分化情况，寻找具有最佳增殖分化能力且性能稳定的细胞代次；探讨不同的冻存方法对BMSCs生物学特性的影响，寻找适宜的犬BMSCs冻存的方法；观察冻存前后BMSCs体内形成牙周支持组织能力的变化。 方法：本研究分为三部分 第一部分体外BMSCs性能稳定性研究 从Beagle犬股骨抽取骨髓，培养，传代，每日用倒置显微镜观察细胞生长情况及形态变化；选择生长良好的第4、5、6、7代BMSCs，显微镜下观察计数细胞贴壁情况；MTT法测定细胞的增殖活性，描绘细胞生长曲线图；检测第5、10、15天时碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性；倒置显微镜下见细胞结节状聚集时行VonKossa染色观察其体外矿化情况。 第二部分不同冻存方法对BMSCs体外生物学活性的影响 从Beagle犬股骨抽取骨髓，培养，传代，至第4代时将其以不同细胞浓度(1×107/L、1×108/L、1×109/L)、不同冻存保护剂(DMSO)浓度(5％、10％、15％)、不同降温方式以及消化或原位等方法进行冻存，一个月后细胞复苏传至第7代，观察传代细胞形态，测定细胞存活率、贴壁率、MTT值、ALP活性，以确定冻存对其体外增殖分化能力的影响。 第三部分自体移植冻存前后BMSCs修复牙周组织缺损的组织工程研究 在5只beagle犬的双侧上颌尖牙(6颗)、下颌尖牙(10颗)、下颌第一磨牙(10颗)牙根颊侧釉牙骨质界根方5mm处各制备一个5×5mm2大小的水平型骨缺损，随机分成三个组，即空白对照组、未冻存细胞组和冻存细胞组，空白组仅植入载体胶原膜，未冻存细胞组和冻存细胞组以5×106/mL细胞浓度接种于5×5mm2大小的胶原膜上，体位复合培养24h后植入缺损内，以7×7mm2不可降解聚四氟乙烯(e-PTFE)膜覆盖缺损部位，钛钉固定。8周后处死动物，标本行组织学处理，于光镜下观察。 结果：(1)原代细胞接种后生长迅速，呈成纤维细胞样集落生长；第4、5、6、7代BMSCs1～7天MTT值逐渐增高，7天后MTT值无明显增高，各代细胞同一时间点统计分析无统计学差别(P＞0.05)；在5、10、15天时ALP活性均随时间延长逐渐增高，各时间点各代细胞ALP水平无统计学差异(P＞0.05)；原代细胞和传代细胞持续培养均能形成粟白色结节状物，经VonKossa染色后呈棕黑色。(2)各种方法冻存的BMSCs均有一定的增殖和分化能力，冻存后增殖能力有所下降，但保存较高的分化能力。高细胞浓度、10％DMSO的冻存保护剂有利于细胞活性的保存(P＜0.05)，三种降温方式对BMSCs生物特性的影响没有显著差别。-80℃原位冻存时BMSCs仍保存了一定的增殖、分化能力。(3)植入细胞后在牙根面可见薄层牙骨质样组织形成，新生牙周膜在新生牙骨质和新生牙槽骨样组织间形成，但未察及穿通纤维。植入冻存BMSCs和未冻存BMSCs细胞组牙周组织再生量大于空白对照组(P＜0.05)，植入冻存细胞与非冻存细胞组间没有统计学差别(P＞0.05)。 结论；犬BMSCs可以成功分离培养，至少在4～7代细胞内增殖分化性能稳定，可以作为组织工程的种子细胞。较高的冻存细胞浓度、选用含10％DMSO的冻存保护剂、分阶段的降温方式有利于冻存；-80℃原位冻存可作为BMSCs短期的保存方法。植入BMSCs可以获得牙周组织再生，冻存对BMSCs体内分化形成牙周组织能力没有显著影响。

目录

主要英文缩略词

前言

第一部分骨髓基质细胞体外生物等学特性稳定性的实验研究

第二部分不同冻存方法对BMSCs体外生物学活性的影响

第三部分自体移植冻存骨髓基质细胞修复牙周组织缺损的实验研究

全文总结

参考文献

文献综述骨髓基质细胞在牙周组织工程研究中的应用进展

附：中英文文献中骨髓基质细胞的同义词

致谢