抗菌肽和植酸酶在酵母中的异源表达研究

摘要

抗菌肽是一种来源于各类生物体中的小分子蛋白，稳定性较强，抗菌作用明显，且不会产生耐药性。因其具有独特的作用机制且抗菌谱广的特点，近年来，被广泛地用作动物饲料添加剂，可防止饲料在加工和运输过程中发生变质，且动物食用后也可达到预防疾病的效果，因此在动物养殖行业具有非常重要的作用和迫切需求。
　　植酸，即肌醇六磷酸，是磷和肌醇的主要储存形式，它广泛分布在植物组织中或饲料及粮食产品中。非反刍类动物由于缺少植酸酶而不能直接利用植酸中的磷，将植酸酶制剂添加到动物饲料中，可促进动物对饲料中磷的利用，同时还可减少磷对环境的污染。
　　抗菌肽和植酸酶可作为两种高效的饲料添加蛋白添加到动物饲料中去，达到防止饲料变质和促进动物消化吸收的目的。但是，天然的目标产物产生菌产量非常低且不易分离纯化，因此，本研究旨在利用基因工程技术，将人工合成的抗菌肽基因和来源于青霉菌的植酸酶基因导入酵母表达载体，通过诱导目的基因在酵母中异源表达，提高抗菌肽和植酸酶的产量，进一步达到工业化生产的目的。主要取得了以下研究结果。
　　1、人工合成了来源于臭蛙的抗菌肽Odorranain基因，构建了毕赤酵母表达载体pPICOG，获得了具有广谱抗菌活性的重组毕赤酵母菌株OG9，该菌株在摇瓶诱导培养到96 h时的抑菌活性最高，表明该条件下，酵母表达Odorranain的量最高，生物效价达到2.47×109 U/L。SDS-PAGE结果表明重组酵母菌株能够正确表达Odorranain。发现pH6.5、接种量为50 g/L、选择BMMY培养基能够显著提高酵母Odorranain的表达量。
　　2、以本实验室构建的产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母基因工程菌作为出发菌株，在摇瓶培养的基础上，建立了10-100 L发酵罐高密度发酵的工艺及产物分离纯化方法。研究了不同培养基、菌体密度、诱导物及其添加方式等对产物的影响。结果表明，用BSM培养基发酵培养至菌体密度达到190 g/L时开始添加乳糖诱导，乳糖添加量为5kg，补料流加速度为1 L/h，诱导25 h，菌体细胞湿重达280 g/L，发酵液中蛋白产量达27.8 mg/L，抗菌肽PSI效价达到2.36×109 U/L。采用多种分离纯化方法对发酵液中抗菌肽PSI进行分离纯化，结果表明，阴离子交换色谱纯化效率最高，纯化后蛋白效价为8.83×109 U/L，其次为丙酮沉淀、超滤、硫酸铵分级沉淀，纯化后蛋白效价依次为6.35×109、4.56×109、3.28×109 U/L。
　　3、以本实验室筛选得到的植酸酶菌株青霉Penicillium glabrum NMH2-3-1作为出发菌株，经PCR扩增出植酸酶基因片段，克隆至酵母表达载体pKLAC1中，构建酵母重组质粒pKLAC1-phy，将该质粒经SacⅡ酶切线性化后电击转入乳酸克鲁维酵母细胞，乳糖诱导酵母表达后用含有植酸钙的选择性培养基及SDS-PAGE鉴定表达产物并计算酶活。结果表明:植酸钙平板出现了明显的水解圈，表达产物经SDS-PAGE鉴定，在约蛋白分子量22 KD处有蛋白条带，当诱导至120 h时，酶活性可达8000 U/mL，蛋白产量为2.3 mg/mL，成功实现了植酸酶在乳酸克鲁维酵母中的表达。
　　4、进一步探究了通过酵母异源表达所产植酸酶的酶学性质，在30℃、200r/min条件下，对酵母基因工程菌株进行摇瓶发酵，培养120 h后，获得粗酶液，经过滤离心后测得，该酶在pH3.0-7.0之间都有活性，且pH5.0时酶活性最高;该酶的最适反应温度为50℃，在70℃水浴处理10、20和40 min后酶活性仍分别保留58.3％、47.5％和25.6％，具有较好的耐热性;通过对消化酶的耐受实验表明，该酶不容易被胃蛋白酶和胰蛋白酶水解;高浓度的Cu2+、Mn2+和Al3+对植酸酶活性具有显著的抑制作用。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 抗菌肽概述

1．1．1 抗菌肽的分类及特性

1．1．2 抗菌肽的作用机制

1．1．3 抗菌肽转基因表达策略

1．1．4 抗菌肽的分离纯化方法

1．1．5 抗菌肽的应用

1．2 植酸酶概述

1．2．1 植酸酶来源及转基因表达策略

1．2．2 植酸酶的应用

1．3 酵母异源表达系统

1．3．1 毕赤酵母表达系统

1．3．2 乳酸克鲁维酵母表达系统

1．4 本研究的目的和意义

2 臭蛙抗菌肽基因合成及酵母异源表达

2．1 材料与方法

2．1．1 质粒及菌株

2．1．2 仪器和试剂

2．1．3 培养基

2．2 臭蛙抗菌肽基因序列的设计与合成

2．3 毕赤酵母基因工程菌株的构建

2．3．1 构建重组质粒及转化毕赤酵母菌株

2．3．2 阳性转化子的诱导培养

2．3．3 检测抗菌肽活性

2．3．4 抗菌肽生物效价测定

2．3．5 SDS-PAGE鉴定抗菌肽

2．3．6 重组菌株的NTG诱变

2．3．7 影响抗菌肽odoranagin效价的因素

2．3．8 数据统计与分析

2．4 实验结果

2．4．1 重组表达质粒pPICOG的鉴定

2．4．2 菌株的转化与筛选

2．4．3 重组酵母菌株的生长情况测定

2．4．4 重组酵母菌株质粒丢失率测定

2．4．5 NTG诱变筛选重组表达稳定及高产菌株

2．4．6 酵母重组菌株OGmu13发酵条件的优化

2．4．7 SDS-PAGE分析重组菌产抗菌肽odoranagin

2．4．8 抗菌肽odoranagin的耐热性研究

3 产抗菌肽PSI的重组乳酸克鲁维酵母高密度发酵及产物的分离纯化

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 重组乳酸克鲁维酵母基因工程菌PN21高密度发酵

3．1．3 抗菌肽生物效价及产量检测

3．1．4 响应面法优化发酵条件

3．1．6 发酵产物的分离纯化

3．1．7 SDS-PAGE检测

3．2 结果与分析

3．2．1 重组抗菌肽PSI乳酸克鲁维酵母基因工程菌高密度发酵

3．2．2 不同发酵培养基对抗菌肽表达量的影响

3．2．3 葡萄糖添加量、流加速度对菌体生长的影响

3．2．4 乳糖或半乳糖诱导对抗菌肽产量的影响

3．2．5 诱导重组菌抗菌肽表达条件的优化

3．2．6 重组菌抗菌肽表达条件的响应面法优化

3．2．7 发酵液中抗菌肽PSI的分离纯化

4 植酸酶基因克隆及在酵母中异源表达的研究

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 基因组DNA提取

4．1．3 青霉植酸酶phyA基因的PCR扩增

4．1．4 表达载体pKLAC-phy的构建

4．1．5 重组质粒pPIC9K-phy电击转化酵母细胞

4．1．6 酵母工程菌诱导表达及初步鉴定

4．1．7 磷标准曲线的制作

4．1．8 植酸酶酶活的测定及产物鉴定

4．1．9 植酸酶酶学性质的研究

4．1．10 数据统计与分析

4．2 结果与分析

4．2．1 植酸酶基因表达片段的POR扩增

4．2．2 重组质粒pKLAC-phy的鉴定

4．2．3 植酸钙平板初筛阳性酵母工程菌

4．2．4 磷标准曲线的绘制

4．2．5 表达活性检测及表达量分析

4．2．6 不同因素对酶活的影响

5 讨论与结论

5．1 讨论

5．2 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果