黄花补血草内生真菌的分离纯化及其次级代谢产物的生物活性研究

摘要

植物内生菌在和宿主植物长期互惠共生的情况下能够产生与宿主相同或相似的化学成分，它们在植物内广泛存在，并且表现出丰富的资源和代谢产物多样性。补血草属植物含有丰富的生理、药理活性物质，且还具有多种药理作用。鉴于此我们选用白丹花科Plumbaginaceae补血草属植物黄花补血草Limonium aureum作为植物材料，对黄花补血草的内生真菌及其代谢产物的生物活性进行研究。
　　采用组织块分离法，从黄花补血草根部分离得到21株内生真菌，这些菌株菌落形态多样，生长特点各有不同。通过菌落形态观察和显微观察，并对照《真菌鉴定手册》，对黄花补血草产孢的9株内生真菌进行鉴定。9株内生真菌都属于半知菌纲(Fungi lmperfecti)丛梗孢目（Moniliales），其中聚端孢霉属[Trichotheciumsp.]2株、青霉属[Penicillium sp.]3株、瓶梗青霉属[Paecilomyces sp.]3株、镰孢霉属[Fusarium sp.]1株。
　　采用MTT法对黄花补血草21株内生真菌发酵产物进行抗肿瘤活性检测。结果显示:黄花补血草内生真菌发酵液各部位84个样品，对Hep-G2、A549和SMMC-7721肿瘤细胞抑制率大于70％的有38个，占总数的45.24％。其中，有14个乙酸乙酯样品对SMMC-7721细胞的抑制率都大于80％，说明本实验中分离得到的黄花补血草内生真菌的抗肿瘤活性主要集中在发酵液的乙酸乙酯萃取部位，且对SMMC-7721细胞的抑制作用较明显。
　　采用滤纸片法对黄花补血草21株内生真菌发酵产物进行抑菌活性检测。抑菌活性检测结果表明:29个样品对指示菌有不同程度的抑菌作用，占样品总数的34.52％，且正丁醇部位的21个样品对6种指示菌的生长均有抑制作用。其中H101和H201的乙酸乙酯和正丁醇萃取部位对6种指示菌均有较强的抑菌作用。并选取H101和H201为最小抑菌浓度实验的研究对象，结果显示:其中H101和H201发酵液乙酸乙酯和正丁醇萃取部位对6种指示菌的最小抑菌浓度能达到0.25mg/mL。
　　抗氧化活性结果表明:有46个样品表现出总还原力，占样品总数的54.76％。但是46个样品中，维生素C的相当含量都未超过100μg/mg，其中维生素C相当含量最高的是H201菌体部位(99.01μg/mg)。此次实验中分离得到黄花补血草内生真菌没有明显的抗氧化活性。
　　通过薄层层析、柱层析和制备薄层等分离方法，对菌株H301二乙部位和菌体乙醇提取物进行分离，结果从二乙部位未分得单体化合物;从菌体乙醇提取物中得到1个单体化合物-麦角甾醇。

目录

声明

摘要

第1章 综述

1．1 植物内生菌研究概况

1．1．1 内生菌的研究历史

1．1．2 内生菌与宿主的关系

1．1．3 内生真菌的普遍性和多样性

1．1．4 内生菌的生物学和生态学意义

1．1．5 植物内生菌产生的活性物质

1．1．6 植物内生菌发展前景

1．2 补血草属植物研究概况

1．2．1 补血草属化学成分

1．2．2 药理作用

1．2．3 黄花补血草研究概况

1．3 本课题的研究内容、目的及意义

第2章 黄花补血草内生真菌分离及形态学鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器

2．1．4 培养基的制备

2．2 实验方法

2．2．1 黄花补血草内生真菌的分离与保存

2．2．2 黄花补血草内生真菌的形态学观察及初步鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 黄花补血草内生真菌的分离

2．3．2 黄花补血草内生真菌的鉴定

2．4 结论

第3章 黄花补血草内生真菌次级代谢产物活性研究

3．1 实验材料

3．1．1 菌株及细胞株

3．1．2 培养基

3．1．3 试剂及仪器

3．2 实验方法

3．2．1 内生真菌的发酵及发酵产物的制备

3．2．2 肿瘤细胞的培养

3．2．3 内生真菌发酵产物体外抗肿瘤(MTT法)活性研究

3．2．4 内生真菌发酵产物抑菌活性研究

3．2．5 内生真菌发酵产物抗氧化活性研究

3．3 结果与讨论

3．3．1 黄花补血草内生真菌胞外多糖测定结果

3．3．2 抗肿瘤活性结果

3．3．3 抑菌活性结果

3．3．4 抗氧化结果

3．4 结论

第4章 黄花补血草内生真菌发酵产物的化学成分分离

4．1 实验材料

4．1．1 菌株及培养基

4．1．2 试剂

4．1．3 仪器

4．2 实验方法

4．2．1 H301的大量发酵及其发酵液次级代谢产物的分离

4．3 结果与分析

4．3．1 菌株H301发酵产物样品的制备

4．3．2 菌株H301发酵产物化学成分分离

4．3．3 菌株H301菌体乙醇提取物的化合物结构鉴定

4．4 结论

结论

参考文献

致谢

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