α-硫辛酸对半胱氨酸诱导静脉内皮细胞损伤后赖氨酰氧化酶表达的影响

摘要

目的:通过半胱氨酸(Hcy)诱导静脉内皮细胞损伤后赖氨酰氧化酶(LOX)的表达变化及α-硫辛酸(ALA)对LOX的调节作用,探讨ALA对内皮功能的保护作用及其机制,为ALA防治内皮细胞功能损伤提供理论依据。
　　 方法:
　　 1.将HUVEC-12细胞株进行人工传代培养。
　　 2.加入不同浓度Hcy、ALA培养不同时间,用MTT法测定细胞存活量。
　　 3.运用共聚焦显微镜观察不同浓度Hcy、ALA对细胞内活性氧(ROS)生成及清除情况。
　　 4.提取细胞RNA,RT-PCR后以MMP-2、LOX与β-actin的mRNA比值进行半定量分析。
　　 5.提取细胞蛋白,以LOX与β-actin的OD比值进行定量分析。
　　 结果:
　　 1.Hcy对内皮细胞存活有明显抑制作用。不同浓度Hcy处理后,细胞明显受抑制,呈浓度依赖性(P＜0.01)。经Hcy处理后加入不同剂量ALA,细胞存活量明显上升,不同组间差异具统计学意义(P＜0.01)。
　　 2.Hcy能诱导内皮细胞产生ROS,胞内ROS含量随Hcy浓度增加而升高。以Hcy处理后分别加入不同剂量ALA,胞内ROS含量明显减少,不同组间差异具统计学意义(P＜0.05)。
　　 3.Hcy呈浓度依赖性下调内皮细胞LOX表达及上调MMP-2mRNA表达。RT-PCR结果提示予不同浓度Hcy处理后LOXmRNA表达明显减少,呈浓度依赖性(P＜0.01)。MMP-2mRNA表达随Hcy浓度增加而升高。应用LOX抑制剂BAPN后,MMP-2mRNA表达明显增加。除Hcy中、高浓度组外,其余各组间差异均具统计学意义(P＜0.01)。Westernblot结果提示LOX表达随Hcy浓度增加而降低。不同组间差异具统计学意义(P＜0.01)。
　　 4.ALA可抑制Hcy刺激引起LOX表达下调及MMP-2上调。RT-PCR结果提示经Hcy处理后分别加入不同剂量ALA,细胞LOXmRNA相对表达量呈上升趋势。MMP-2mRNA表达较Hcy组降低,应用BAPN后,MMP-2mRNA表达增加。不同组间差异具统计学意义(P＜0.01)。Westernblot结果提示经Hcy处理与加入ALA后比较,Hcy组细胞LOX蛋白明显低于ALA组。经重复测量方差分析,不同组间差异具统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.ALA明显增高受损内皮细胞活性,提示ALA对内皮细胞具有保护作用。
　　 2.Hcy可通过增加细胞胞内ROS生成引起内皮细胞氧化损伤。予ALA干预后胞内ROS含量下降,提示ALA可通过减少内皮细胞ROS生成,改善细胞氧化应激损伤,达到保护内皮细胞的作用。
　　 3.Hcy引起内皮细胞MMP-2表达增加,可能是通过Hcy下调细胞LOX表达来实现的。提示Hcy可通过抑制细胞LOX表达引起MMP-2表达异常,促使ECM降解、改变血管壁弹性,从而导致内皮功能障碍,这可能是Hcy引起动脉粥样硬化的重要机制。
　　 4.ALA可干预内皮细胞中Hcy对LOX的表达抑制,并通过该抑制作用下调细胞MMP-2表达,提示ALA可通过上调LOX水平改善内皮功能,防止动脉粥样硬化的形成或进展。