弧菌YeaZ基因表达、蛋白性质及其对环境微生物促生长作用研究

摘要

弧菌广泛分布于江河湖泊、海洋、高盐土壤等自然环境，跟人类生活密切相关，有些种是水产养殖动物的益生菌，有些能够引起人和动物疾病。弧菌在恶劣环境如低温、辐射、缺乏营养等情况下能进入休眠状态，即活的非可培养状态（VBNC），用一般方法检测不到VBNC细菌，但仍有一定代谢活力，条件适宜时，会重新生长。许多革兰氏阳性细菌存在一种细菌复苏促进因子蛋白，能促进不同状态细菌细胞的生长及VBNC状态细胞复苏，在部分革兰氏阴性细菌中发现了复苏促进因子活性的类似蛋白，具有明显的促细胞生长活性，但其作用机制有待阐明，通过研究VBNC细菌复苏，可以获得更多有应用价值新种，探索 VBNC菌未被发现的新生物功能。
　　本文从哈维弧菌（Vibrio harveyi）和溶藻胶弧菌（Vibrio alginolyticus）基因组扩增出一种类似于革兰氏阳性细菌细胞复苏促进因子的yeaZ基因，片段大小为702 bp，能够编码233氨基酸残基。yeaZ基因与大肠杆菌糖蛋白酶、耶尔森菌M22肽酶YeaZ基因序列相似性分别为59%和55%，通过对不同种类弧菌复苏促进因子yeaZ基因的检测，进一步发现该类yeaZ基因在弧菌类群中普遍存在，序列相似性在67%-94%。将yeaZ基因进行原核表达，SDS-PAGE电泳分析发现重组蛋白分子量为30 kDa。将YeaZ蛋白添加到VBNC状态的哈维弧菌细胞悬液中，能明显促进非可培养细胞的复苏，添加YeaZ蛋白的实验组在28℃培养8 h后细胞实现复苏，可培养细菌数量最大为2.88×105 cfu/ml，随着哈维弧菌在VBNC状态停留时间延长，能复苏的可培养细菌数量逐渐变小。当细菌在VBNC保持120 d后，添加YeaZ蛋白，可培养细菌数量为1.13×103 cfu/ml。其他对照组不能实现细胞复苏，检测不到可培养细菌。
　　用人工合成底物4-Methylumbelliferyl-β-D-N-N’-N”-triacetylchitotriose检测发现弧菌复苏促进因子YeaZ具有微弱溶菌酶活性。溶菌酶比活力为7.05 U/mg，最适pH为5.0，在pH4.0-7.0和20-50℃温度下酶较稳定，当温度超过50℃时，酶活力丧失。Ca2+、Mg2+、Zn2+对酶有抑制作用，1 mmol/l的Co2+对溶菌酶活力有微弱促进作用。通过PCR定点突变技术对其溶菌酶活性中心位点氨基酸Thr-71和Asp-112进行了突变，发现突变的YeaZ溶菌酶活性发生部分降低，分别为4.75和2.50 U/mg，其突变体仍具有复苏促进作用。
　　以偶氮酪蛋白及不同种类人工合成蛋白酶底物BAPNA、ATEE和BTEE为底物测定YeaZ的蛋白酶活性，发现YeaZ能不同程度的水解这些蛋白底物。其中以偶氮酪蛋白为底物的蛋白水解酶比活力为30 U/mg，以BAPNA为底物的酰胺酶比活力为1190 U/mg，以ATEE和BTEE为底物的酯酶比活力分别为365和197.5 U/mg。同时以体外定点突变技术对蛋白酶可能的活性位点氨基酸Asp88、Ser185和Trp169进行了定点突变，构建了不同突变体的表达载体，并在大肠杆菌BL21进行了表达。发现突变后的蛋白水解能力、蛋白酰胺酶活性以及酯酶活性都有不同程度下降或者完全丧失。其中突变体Asp88–Ala、Ser185–Leu、Trp169–Glu的蛋白水解能力分别下降了66.67%、0.00%和50.00%。突变体Asp88–Ala、Trp169–Glu胰蛋白酶活力分别下降了84.93%和32.88%，而同时带有Asp88–Ala和Ser185–Leu突变的突变体蛋白酶活力完全丧失，说明这几个氨基酸是蛋白酶活性中心。
　　采用平板计数和变性梯度凝胶电泳的方法研究了YeaZ蛋白对极端环境样品土壤可培养细菌的影响，发现添加YeaZ的实验组可培养细菌的数量和多样性都有一定程度的提高，其中可培养细菌数量分别从0.17×103和2.03×103 cfu/g增加到1.00×103和5.55×103 cfu/g，增加了2-5倍；从DGGE图谱可以看出添加YeaZ的实验组条带明显比对照组多。从添加YeaZ的实验组分离得到南极微球菌（Micrococcus antarcticus）、玫瑰色库克菌（Kocuria rose）、新疆盐地杆菌（Salinibacterium xinjiangense）、南极游动球菌（Planococcus antarcticus）、Bacillus oceanisediminis、短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）、解木聚糖类芽孢杆菌（Paenibacillys xylanilyticus）、Microbacterium maritypicum、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、嗜盐芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）、Bacillus niabensis、杜氏大洋单胞菌（Oceanimonas doudoroffii）和台湾佐氏菌（Zobellella taiwanensis）等更多细菌种类。
　　论文还研究了西部荒漠草原土壤可培养细菌季节动态变化与土壤理化因子之间的相关性，发现荒漠草原可培养细菌季节动态变化显著，土壤细菌数量垂直分布明显，可培养细菌数量与全年降雨量和温度关联较大。1月、4月、7月和10月可培养细菌数量分别为0.13×107、4.09×107、5.33×107和1.80×107 cfu/g，全年不同季节共分离出不同的菌株72株，分别属于厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidates）。芽孢杆菌属（Bacillus）作为优势菌属在不同月份所占比例分别5.56%、28.57%、50.00%和20.83%。从荒漠草原分离出的放线菌主要为链霉菌属（Atreptomyces）、小单孢菌属（Micromonspora）、链轮丝菌属（Streptoverticillium）、间孢囊菌属（Intrasporangium），其中链霉菌属是优势菌群，占放线菌属的50.00%，真菌类型单一，主要为交链孢霉属（Alternaria）和芽枝霉属（Cladosporium）。土壤温度和含水率是影响土壤微生物数量和多样性的主要因素，另外土壤营养元素（N，P，K）在不同程度上对土壤微生物数量也有一定影响。

目录

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附表索引

第 1 章 引言

1.1 弧菌分布及生物学性质

1.2 细菌活的非可培养（ VBNC）

1.3 复苏促进因子 Rpf/YeaZ 的发现及蛋白家族基因组成

1.4 细胞复苏促进因子蛋白家族的生物学活性

1.5 细胞复苏促进因子在自然环境中的应用

1.6 土壤微生物多样性

1.7 本课题研究意义及目的

1.8 本课题研究技术路线

第 2章 弧菌复苏促进因子 YeaZ基因克隆与原核表达

2.1 前言

2.2 实验材料与仪器

2.3 不同弧菌 yeaZ 基因的检测

2.4 哈维弧菌与溶藻胶弧菌 yeaZ 基因的原核表达

2.5 Bradford 法测定纯化蛋白浓度

2.6 Western-Blotting 检测哈维弧菌 yeaZ 基因的表达

2.7 YeaZ 对 VBNC 状态哈维弧菌的复苏作用

2.8 结果与分析

2.9 讨论

第 3章 YeaZ溶菌酶活性及活性位点的 PCR定点突变分析

3.1 前言

3.2 实验材料与仪器

3.3 YeaZ 溶菌酶性质的研究

3.4 PCR 定点突变研究 YeaZ 溶菌酶的活性位点

3.5 结果与分析

3.6 讨论

第 4章 YeaZ蛋白酶活性及活性位点的 PCR定点突变分析

4.1 前言

4.2 实验试剂与设备

4.3 YeaZ 的蛋白酶活性研究

4.4 PCR 定点突变研究 YeaZ 的蛋白酶活性位点

4.5 结果与分析

4.6 讨论

第 5章 复苏促进因子 YeaZ对新疆火焰山与甘肃民勤盐碱地土壤可培养细菌的影响

5.1 前言

5.2 实验材料与设备

5.3 实验方法

5.4 结果与分析

5.5 讨论

第 6 章 白银地区半干旱荒漠草原土壤可培养微生物多样性

6.1 前言

6.2 实验材料与设备

6.3 实验方法

6.4 结果与分析

6.5 讨论

第 7 章 结论

参考文献

致谢

附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

附录 B 试验所用试剂配制